RNA高通量组学研究

RNA高通量组学研究田巍，[e-mail]转录组表达谱表达谱二代小RNA测序分析降解组分析转录组表达谱表达谱二代小RNA测序分析降解组分析Ref-seqDenovo-seqmRNA分析流程mRNA分析基因结构优化可变剪接分析融合基因分析预测新转录本SNP分析表达量分析基因结构优化首先，将reads比对到基因组，提取基因组中被uniquemappingreads覆盖的次数大于或等于某阈值（默认为2）且位置连续的区域作为转录活性区(TranscriptionActiveRegion，TAR，图中蓝色方块区域)；然后通过paired-endreads（图中紫色线条）将不同的TAR连接形成潜在的genemodel；最后，通过比较潜在genemodel与现有基因注释的差别，对基因的5'端和3'端进行延长（图中表现的仅是基因3'端发生延长的情况）。可变剪切分析可变剪接使一个基因产生多个mRNA转录本，不同mRNA可能翻译成不同蛋白。因此，通过可变剪接一个基因可能产生多个蛋白，极大地增加了蛋白多样性（Black,2003；Stamm,2005；Lareau,2004）。虽然已知可变剪接在真核生物中普遍存在，但我们可能仍低估了可变剪接的比例，最近，基于高通量测序的可变剪接研究在人（Pan,2008；Wang,2008；Sultan,2008）、小鼠（Tang,2009；Mortazavi,2008）、拟南芥（Filichkin）中发现了很多新的可变剪接事件。融合基因分析*Redtexthighlightsfirst36-merofthe100-merreads可变剪切/融合基因软件•Tophat：TopHat是基于Bowtie的将RNA-Seq数据mapping到参考基因组上，从而鉴定可变剪切（exon-exonsplicejunctions）。需要其它软件为：Bowtie、TopHat、Cufflinks、samtools预测新转录本GenomicintergenicregionReadsclusterPairedReadsdistributionPaired-End(PE)Reads现有数据库中对转录本的注释可能还不全面，通过高通量测序我们能检测到新的转录本（Mortazavi,2008）。我们首先从潜在genemodel中挑选出长度大于150bp且平均覆盖度大于2的genemodel，再从中找出位于基因间区域（一个基因3'端下游200bp到下一个基因5'端上游200bp之间的区域）的潜在genemodel作为候选的新转录本。SNP分析ThispositioninChr1isaclearSNPrelativetoreferenceHumanGenome.InourAdiposesampleitlookslikeheterozygousSNP(21Cand21T),butinColonthisappearstobehomozygous(all30readsareC).TheseRNAsamplescomefromtwodifferentindividuals.转录组表达谱表达谱二代小RNA测序分析降解组分析统计分析：a)测序质量评估b)测序饱和度分析c)随机性评估d)cleantag相关分析e)Read在参考基因组上的分布f)Read在参考基因上的分布表达量分析：a)基因覆盖度统计b)基因表达统计c)差异基因统计d)差异表达基因筛选e)差异基因表达模式聚类f)GO功能显著性富集分析g)pathway显著性富集分析h)蛋白互作网络分析测序原始数据*.fq格式序列IllunimaHiSeq™2000测序错误率与测序质量值简明对应关系Single-End&Paired-EndcDNAcDNARead1,90basesRead2,90basesReads,50basesInsertlengthSingle-End(SE)ReadsPaired-End(PE)Reads测序质量评估DGERNA-seq测序饱和度分析DGERNA-seq随机性评估•cDNAfragmentationisusuallystronglybiasedtowardsthe3′endsoftranscripts.•RNAfragmentationprovidesmoreevencoveragealongthegenebody,butisrelativelydepletedforboththe5′and3′endsNatureReviewsGenetics(2009)Cleantag相关分析拷贝数分布统计Cleantag比对统计Reads在参考基因组上的分布Reads在参考基因上的分布基因覆盖度统计统计分析：a)测序质量评估b)测序饱和度分析c)随机性评估d)cleantag相关分析e)Read在参考基因组上的分布f)Read在参考基因上的分布表达量分析：a)基因覆盖度统计b)基因表达统计c)差异基因统计d)差异表达基因筛选e)差异基因表达模式聚类f)GO功能显著性富集分析g)pathway显著性富集分析h)蛋白互作网络分析基因表达统计refDGERNA-seqTPM&&RPKMC：比上某个基因的Tag数N：该样品总CleanTag数C:numberofreadsthatareuniquelyalignedtogeneN:totalnumberofreadsthatareuniquelyalignedtoallgenesL:LengthofgeneReadsPerKbperMillionreadsTagPerMillion差异基因统计refDGERNA-seqP-value&&FDRFDR（FalseDiscoveryRate）差异表达基因筛选•以FDR≤0.01且倍数差异2倍以上来筛选差异表达基因。•考虑基因真实的表达量。•参考GO和Pathway分析结果。•考虑自己的实验需要，是否有特别关注的基因。•差异最大的前一百条。•以实验验证为准。差异基因表达模式聚类聚类软件•聚类：cluster•查看：JavaTreeviewGO功能显著性富集分析首先把所有差异表达基因向GeneOntology数据库的各个term映射，计算每个term的基因数目。然后应用超几何检验，找出与整个基因组背景相比，在差异表达基因中显著富集的GO条目，其计算公式为：GO功能显著性富集分析GO功能显著性富集分析Pathway显著性富集分析结果：各列的意义：信息分析GO分析常用软件/数据库•GO功能/聚类：Amigo：：•GO注释：Blast2go：•GO聚类图：WEGO：显著性富集分析Pathway分析软件与网页•Pathway功能：KOBAS：•Pathway注释：blast2KO蛋白互作网络分析（cytoscap）转录组表达谱表达谱二代小RNA测序分析降解组分析1）完全配对（RNAinterference），导致特异性断裂，达到基因沉默的目的（由于RNA是单股的，若发现双股RNA会被当作外来病毒，RISC会立即将其切断）2）不完全配对（Translationalrepression），影响基因的转译过程，进而达到调控基因的目的。miRNA的作用机制如下：MiRNAtargetsite预测:通常预测miRNAtargetsite都使用Smith-Watermanalgorithm，该方法是利用不同的参数调整，找到最大吻合的核咁酸区域，而利用此演算法的方法有：Miranda,PicTar,Targetscan等等。MiRNA及miRNAtargetsite资料库:miRBase：此资料库拥有miRNA,miRNAtargetsites资料，其中targetsite资料包含预测及实验证实的，目前版本为V.17，物种包含人类、黑猩猩、恆河猴、大鼠、小鼠等等。TargetScan：此资料库拥有miRNAtargetsites资料，而其资料皆为实验证实的，物種包含人类、黑猩猩、恆河猴、大鼠、小鼠等…等。1.寻找已知miRNA并进行差异分析、聚类分析等2.寻找其他ncRNA，并分类为：rRNA、tRNA、siRNA、piRNA等3.预测新的miRNAmiRNA分析流程miRNA分析流程1.寻找已知miRNA并进行差异分析、聚类分析等2.寻找其他ncRNA，并分类为：rRNA、tRNA、siRNA、piRNA等3.寻找新的miRNAOutputmatch_hairpin.aln：mmu-mir-22ACCTGGCTGAGCCGCAGTAGTTCTTCAGTGGCAAGCTTTATGTCCTGACCCAGCTAAAGCTGCCAGTTGAAGAACTGTTGCCCTCTGCCCCTGGCmmu-mir-2295.((.(((.(((..((((((((((((((((((((.((((((.((.........))))))))))))).))))))))))))))).))).)))...)).structure-42.00******************AGTTCTTCAGTGGCAAGCTTTA*******************************************************mmu-miR-22*22********************************************************AAGCTGCCAGTTGAAGAACTGT*****************mmu-miR-2222..................AGTTCTTCAGTGGCAAGCTTT........................................................t000466721147..................AGTTCTTCAGTGGCAAGCTTTA.......................................................t00109912245..................AGTTCTTCAGTGGCAAGCTT.........................................................t00238402014..................AGTTCTTCAGTGGCAAGCT..........................................................t0032613199..................AGTTCTTCAGTGGCAAGC...........................................................t0045967185..................AGTTCTTCAGTGGCAAGCTTTAT......................................................t0544228231.......................................................AAAGCTGCCAGTTGAAGAAC....................t0528612201.....................................