第六章微生物的生长和环境条件.

第六章微生物的生长和环境条件通过本章的学习，要求掌握：1、微生物生长量的测定方式。2、细菌纯培养生长曲线各个时期的主要特点。3、物理、化学手段用于控制微生物生长的方法及原理。重点：细菌纯培养生长曲线。难点：如何利用细菌纯培养生长曲线的对数生长期来计算细菌的代时和代数。第一节微生物生长的测定一、微生物生长概述生长(Growth)是指细胞从环境吸取营养物质，经代谢作用合成新的细胞成分，细胞各组分有规律的增长，导致细胞体积增大和重量增加。繁殖(Reproduction)微生物生长到一定阶段由于细胞内各种细胞结构的复杂和重建导致产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的整个生物学过程。个体生长个体繁殖群体生长个体生长个体繁殖群体生长+个体与群落间关系二、微生物分离和纯培养获得纯培养的方法①稀释倒平板法pourplatemethod②涂布平板法spreadplatemethod③平板划线分离法streakplatemethod④利用选择培养基分离⑤单细胞（单孢子）分离法纯培养(pureculture)——只有一种微生物生长的培养物，或者严格的说是从一个细胞经过培养繁殖而得到的后代.1、稀释倒平板法操作较麻烦，对好氧菌、热敏感菌效果不好！2、涂布平板法使用较多的常规方法，但有时涂布不均匀！稀释的菌液融化的固体培养基3、平板划线分离法特点：快速、方便。分区划线（适用于浓度较大的样品）连续划线（适用于浓度较小的样品）4、选择培养基分离法E.coli含氨苄青霉素的LB平板培养基没有一种培养基或一种培养条件能够满足自然界中一切生物生长的要求，在一定程度上所有的培养基都是选择性的。含氨苄青霉素降解酶基因的质粒•利用选择培养基分离根据所要分离的菌种的特性选用培养基：①分离真菌用马丁氏培养基，pH偏酸；分离放线菌用高氏1号，pH中性偏碱。②根据不同菌对化学试剂的敏感性：分离放线菌，培养基中加10%酚，抑制细菌、真菌；从土壤中分离真菌，加链霉素，抑制细菌生长。③根据分离对象的营养特征：分离能发酵纤维素的菌株，培养基以纤维素为唯一碳源。分离固氮菌，用无氮培养基。分离厌氧菌，可以消除培养基中的氧气5、单细胞挑取法毛细管法：用毛细管提取微生物个体，适于较大微生物显微操作仪：用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢子小液滴法：将经过适当稀释后的样品制成小液滴，在显微镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的分离。采用显微分离法在显微镜下从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养。三、微生物生长的测定细胞总数测量（直接计数法）活菌数测量（间接计数法）细胞生物量测量目镜测微尺每个大格又可分为10个小格，每小格的实际长度为0.01mm总长0.1mm镜台测微尺总长1mm共分为10格细胞大小的测定两重合线间镜台测微尺的格数X10两重合线间目镜测微尺的格数细胞总数测量1、显微镜计数器直接计数血球计数板和PetrofHausser细菌计数板2、比浊法原理：在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比，即与光密度（OD值）成正比，菌数越多，光密度越大，但与透光度成反比。活菌数测量1、稀释平板计数法以菌落形成单位——CFU(colonyformingunits)表示。2、最大概率数法(mostprobablenumber,MPN)稀释度10-310-410-510-610-710-8重复数555555出现生长的管数555410X5X5X5X5测定不占优势，但具有某种特殊生理功能的类群。3、浓缩法（滤膜法）测定空气、水等含菌量低的样品当中的活菌数硝酸纤维素膜细胞生物量测量1、细胞干重法2、DNA含量测定法每个细菌细胞约含DNA8.4X10-5ng3、ATP含量测定法4、代谢活性法物质的消耗产生量对氧的吸收发酵糖产酸量二氧化碳的释放量等适用于含菌量高，不含或少含颗粒性杂质的样品微生物细胞中的ATP含量恒定第二节微生物的群体生长一、细菌的生长曲线•概念：将某种单细胞微生物少量接种到恒定容积的液体培养基中培养，定时取样分析。以菌数的对数为纵坐标，生长时间为横坐标作图而得到的生长曲线。生长曲线的制作：接种适温培养定时取样测定生长量生长曲线的制作活菌计数？一条典型的生长曲线至少可以分为延滞期，对数期，稳定期和衰亡期等四个生长时期细菌数量不增加或增加很少，代谢活跃；细胞内的代谢活力强，特别是合成一些必需的酶类；细胞内RNA，尤其是rRNA的含量很高，细胞的嗜碱性强；细胞体积增大，拉长；抗性有所降低，对不良环境因素表现很敏感。A（一）延缓期（lagphase）少量微生物接种到新培养液后细胞数目不增加的时期影响延滞期长短的因素：菌种：繁殖速度较快的菌种的延滞期一般较短接种物菌龄：“种子”所处的生长曲线上的阶段接种量：接种量增大可缩短甚至消除延滞期培养基成分：营养成分及其变化影响延滞期（二）对数期（logphase）细胞以几何级数速度分裂的一段时期代时最短，生长速度最快；细胞稳定（平衡）生长：细胞内各种物质按比例生长，菌体成分均匀；酶活性高，代谢稳定，菌体大小基本一致。B繁殖代数（n）1——2=212——4=224——8=238——16=2416=1*24x2=x1*2nlgx2=lgx1+nlg2n=（lgx2-lgx1）/lg2n=3.3·lg(x2/x1)代时（G）：即每增加一代所需要的时间G=（t2-t1）/nG=（t2-t1）/3.3·lg(x2/x1)•例如：在一细菌培养液中第一次测得的细菌数为104/ml，经过培养4h后，又测得菌液中的细菌数为108/ml，求此菌的世代时间和在此时间内繁殖的代数。根据公式：G=（t2-t1）/3.3·lg(x2/x1)t2-t1=（4-0）×60min=240minx2=108x1=104lg(x2/x1)=lg108-lg104=8-4=4代入上式G=240/3.3×4=240/13.2=18min•即在上述培养液中，世代时间为18min。•细菌繁殖代数n=(t2-t1)/G=240/18=13.3繁代。影响对数期微生物代时的因素：菌种：不同菌种的代时差别极大营养成分：同一种细菌在营养丰富的培养基中生长，代时较短营养物浓度：影响微生物的生长速率和总生长量培养温度（三）稳定期（stationaryphase）新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等生长速度为零，新生=死亡，达到动态平衡；活菌数总量达到最大值；胞内储藏物开始形成（肝糖粒、脂肪粒等）；某些芽孢菌芽孢开始形成；某些细菌过量积累次级代谢产物，如抗生素、维生素等。C稳定期到来的主要原因：营养物尤其是生长限制因子的消耗营养物的比例失调，例如C/N的比值不合适酸、醇、毒素或H2O2等有害代谢产物的积累pH、氧化还原势等物化条件越来越不适宜（四）衰亡期（declinephase）个体死亡速度超过新生速度，因此整个群体出现负生长生长速率负增长；细胞形态多样，出现畸形，形成衰退型；蛋白水解酶活跃，出现细胞自溶现象；芽孢细菌芽孢大量释放。D二、同步培养•同步培养法synchronousculture：设法使培养的微生物处于比较一致的生长发育阶段上的培养方法。•同步生长（synchronousgrowth）的概念：一个细胞群体中各个细胞都在同一时间进行分裂的状态，称为同步生长，进行同步分裂的细胞称为同步细胞。•同步细胞群体在任何一时刻都处在细胞周期的同一相，彼此间形态、生化特征都很一致，因而是细胞学、生理学和生物化学等研究的良好材料。同步培养方法选择法诱导法离心方法过滤分离法硝酸纤维素滤膜法温度培养基成份控制光照和黑暗交替培养获得同步生长的方法主要有两类：①环境条件诱导法：变换温度、光线、培养基等，造成与正常细胞周期不同的周期变化。②选择法：选择性过滤、梯度离心。物理方法，随机选择，不影响细胞代谢。Helmstetter-Cummings法原理：一些细菌细胞会紧紧吸附于硝酸纤维微孔滤膜上。步骤：菌悬液通过微孔滤膜，细胞吸附其上；反置滤膜，以新鲜培养液通过滤膜，洗掉浮游细胞；除去起始洗脱液后就可以得到刚刚分裂下来的新生细胞，即为同步培养。细菌的同步生长和非同步生长同步生长的时间，因菌种和条件而变化，由于同步群体的个体差异，同步生长不能无限地维持，往往会逐渐破坏，最多能维持2~3个世代，又逐渐转变为随机生长，即非同步化三、细胞的生长周期原核细胞的生长周期一般较短，可分为DNA复制的准备前期（I），DNA复制期（R），细胞分裂期（D）。真核细胞的生长周期第三节环境条件对微生物生长和代谢的影响一些基本术语化疗(Chemotherapy)灭菌(Sterilization)防腐(Antisepsis)消毒(Dis-infection)化疗(chemotherapy)是指利用具有选择性的化学物质如磺胺、抗生素等对生物体内部被微生物感染的组织或病变细胞进行治疗，以杀死组织内的病原微生物或病变细胞，但对机体本身无毒害作用的治疗措施。灭菌（sterilization)是指用物理或化学因子，杀灭物体中的所有活微生物，包括最耐热的细菌芽孢。紫外线灭菌器高压灭菌锅手提式高压灭菌锅防腐(antisepsis)在某些化学物质或物理因子作用下，能防止或抑制微生物生长的一种措施，它能防止食品腐败或防止其它物质霉变。消毒(disinfection)消毒是指杀死或消除所有的病原微生物，可以起到防止感染或传播的作用。但不能杀死所有的芽孢。消毒剂一、温度最低生长温度指微生物能进行繁殖的最低温度界限。最适生长温度指使微生物达到最大生长速度的温度。最高生长温度指微生物能生长繁殖的最高温度界限。致死温度指能在10分钟内杀死微生物的高温界限。致死时间在一定温度下杀死微生物所需要的最短时间。极端嗜热菌嗜热菌中温菌适冷菌嗜冷菌微生物生长的温度类型-125~-5~102025~301025403070低温保藏菌种就是利用这个原理。1）一些细菌、酵母菌和霉菌的琼脂斜面菌种通常可以长时间地保藏在4℃的冰箱中；2）-20℃、-70℃和液氮保藏（-196℃）。当环境温度低于微生物的最适生长温度时，微生物的生长繁殖停止，但微生物的原生质结构并未破坏时，不会很快造成死亡并能在较长时间内保持活力，当温度提高时，可以恢复正常的生命活动。1、低温对微生物的影响低温保藏菌种利用高温灭菌的方法•干热灭菌通过高温干燥的空气达到灭菌效果原理：高温可引起蛋白质、核酸和脂类等重要生物高分子发生降解或改变其空间结构等，从而变性或破坏。湿热灭菌更有效，因湿热蒸汽不但透射力强，还能破坏维持蛋白质空间结构和稳定性的氢键。2、高温对微生物的影响高温下蛋白质不可逆变性，酶变性失活，代谢停滞而死亡。蛋白质含水（%）蛋白质凝固温（oC）灭菌时间(min)5056302574～80301880～90306145300160～17030蛋白质含水量与凝固温度关系干热灭菌干热灭菌160-170℃处理1-2h,适用于玻璃器皿、金属用具等耐热物品的灭菌。优点：可保持物品的干燥。灼热灭菌法常用于金属性接种工具、污染物品及实验材料等废弃物的处理。巴斯德消毒法：用较低的温度（如62-63℃,30min）处理牛奶、酒类等饮料，以杀死其中的病原菌如结核杆菌、伤寒杆菌等，同时又不损害营养与风味的方法。煮沸消毒法：100℃，15min以上。间隙灭菌法：用流通蒸汽反复多次处理的灭菌法。高压蒸汽灭菌法：1.05kg/cm2（15b/in）的蒸汽压，121℃处理15-30min。湿热灭菌各种细菌的芽孢在湿热中的致死温度和致死时间菌种100oC105oC110oC115oC121oC炭疽芽孢杆菌5～10____枯草芽孢杆菌6～17____嗜热脂肪芽孢杆菌____12肉毒梭状芽孢杆菌33010032104破伤风梭菌5～155～10___pH对微生物生长的影响氢离子影响细胞质膜电荷和养料吸收;影响酶的活性;改变环境中养料的可给态和有害物质的毒性;影响代谢产物的积累;抑制杂菌生长。二、氢离子浓度（pH