CTAB提取基因组,步骤及注意事项

蛋白酶K的配制常用浓度（20mg/ml）：称取20mg蛋白酶K，溶于1ml灭菌去离子水中。轻摇直至溶解。RnaseA配制常用浓度（10mg/ml）：称取10mgRnaseA,溶于1ml灭菌去离子水中。100℃煮沸15min，冷却至室温。-20℃保存。因为移液枪量程限制，本实验配置2mg/ml的溶液，即称取10mgRnaseA，溶于5ml灭菌去离子水中。100℃煮沸15min，冷却至室温。-20℃保存。*提取之前准备：CTAB提前65℃预热,蛋白酶K配好,37℃水浴锅开启，37℃预热SDS溶液，异丙醇-20℃预冷，无水乙醇-20℃预冷1.取生长3天的菌液25ml加入到灭过菌的40ml离心管中，绿菌、白菌各两管，5000rpm离心20min，弃上清3天的菌液较好。4天的菌液提取的DNA较多，但是步骤7及后面的步骤中上清均有黄色出现2.分别混合两管绿菌和白菌，加入9.5mlTE缓冲液悬浮沉淀，并加入0.5ml10%SDS，100ul20mg/ml的蛋白酶K，混匀，37℃水浴1h。水浴过程中轻缓颠倒离心管。混合时可以先将菌渣混合再加入TE重悬，也可以先将TE加入到一管，吹打重悬后再全部加入另一管吹打重悬。本步骤的目的是是使细胞破碎，因为菌液比较粘稠，水浴过程中颠倒有助于使细菌与酶及SDS充分接触，SDS有裂解细胞膜的作用蛋白酶K消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解，使DNA从核蛋白中游离出来。3.加入1.5ml5M的NaCl，混匀4.加1.5mlCTAB/NaCl溶液，混匀，65℃水浴30~40min，每10min轻缓颠倒离心管数次。期间配制酚-氯仿-异戊醇（V:V:V=25：24：1）约40ml。高离子强度的溶液中(1.4mol/LNaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，而DNA溶解于液相中轻缓颠倒有助于反应液充分接触5.以后操作要尽可能轻缓，不要剧烈震动6.冰上孵育10min直至离心管内液体冷却此步目的是为了防止温度过高以至于后面加入的酚立刻被氧化掉7.加入等体积（约15ml）酚-氯仿-异戊醇，轻轻摇晃，5000rpm离心20min，将上清移至干净50ml离心管酚是强烈的蛋白质变性剂，能有效使蛋白质变性而除去氯仿有强烈的脂溶性，去除脂类杂质，氯仿有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚离心后有机溶剂在试管底层(有机相)，DNA存在于上层水相中（上层水相可能会有颜色），蛋白质则沉淀于两相之间。吸取上清时千万不要吸到蛋白质层，宁可放弃部分水相异戊醇是表面活性剂，可起到消泡作用（SDS易产生大量泡沫）5ml的枪头装上去的时候可能要用到两个手，那么一定要注意手不能碰到枪头部分8.加入等体积氯仿-异戊醇，轻轻摇晃，静置直至分层，取上清移至干净50ml离心管移液时同样注意不要将非水相部分吸取了9.加等体积-20℃预冷的异丙醇，颠倒混匀，-20℃下静置30min，直至析出沉淀，最好-20℃过夜。异丙醇的作用是使DNA析出，静止时间越长析出的量越多。10.5000rpm离心10min，沉淀DNA，弃上清。用70%乙醇漂洗两次，倒置在洁净的滤纸上吸干11.加入1mlTE，并用去掉尖头的1ml枪头轻轻吹打，转移至灭过菌的10ml离心管。用去掉尖头的枪头是为了减少DNA的断裂转移至10ml的离心管是为了减少后面步骤的损失。取离心管时一定要用镊子，镊子现在酒精灯上烧一下，凉了之后夹取离心管。12.加入25ul2mg/ml的RnaseA（共50ug），37℃水浴30min，水浴完成后冰浴使反应液降温。取等体积酚-氯仿-异戊醇抽提，5000rpm离心10min，将上清移至洁净的10mlEP管中冰浴原因同前，移取上清时同样注意不要扰动下层13.加1/10体积3M的NaAc，及2倍体积的无水乙醇，轻轻颠倒混匀沉淀DNA。-20℃静置20~30min或更长，直至DNA沉淀形成白色絮状物预冷的目的是降低DNA的溶解度加入NaAc是为了提供单价的阳离子，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀14.用灭过菌的折成勾状的1ml枪头勾出DNA沉淀，转入新的10ml离心管。70%乙醇漂洗两次，在吸水纸上吸干。勾状枪头的做法：首先装上枪头，选取镊子中部加热一下，待稍冷不至于将枪头烫坏的时候，将枪头慢慢靠近酒精灯至适当的位置，用镊子夹住枪头轻轻往一边折。冷却变形。枪头变形60°就可以了，但在操作的过程中不要把枪头烫坏了。如果DNA的量很少，也可选择1.5ml的离心管，但一定要确保70%的酒精能够漂洗充分吸水纸上吸干一般很难做到，因为DNA絮状物位多孔物，里面结合了很多水，吸水纸不能进去吸。只能在超净台上等他慢慢吹干，时间较长15.溶于1mlTE溶液。-20℃保存看具体要求需不需要溶于TE中。