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1/3细胞支原体污染常用支原体检测方法和试剂盒介绍(2016年10月16日)哺乳动物细胞的培养,支原体(Mycoplasma)污染是个世界性的问题。支原体污染几乎可以改变细胞的所有参数,导致实验结果的不准确、甚至完全错误。从2013年开始,《Nature》期刊已正式要求投稿的文章,如涉及细胞培养都要进行支原体检测。相信会有越来越多的高水平期刊将做出同样的支原体检测要求。目前,细胞支原体污染常用的支原体检测方法主要有:一、培养法原理:将待检测样品先接种到支原体液体培养基中大量繁殖,然后再转接种到支原体固体培养基中,培养一段时间后(大约一个月),如果固体培养中,出现典型的支原体菌落,则说明待测样品有支原体污染。优点:支原体培养法是相对可靠的支原体检测技术,也是我国药典认可的方法之一。缺点:(1)培养法非常耗时的,需要数周,不适合作为细胞培养液中支原体污染的快速检测;(2)通过固体培养法无法检测污染细胞的一种最常见的支原体,即猪鼻支原体(M.Hyorhinis)。这是因为猪鼻支原体无法在支原体固体培养基上形成可见的菌落。而猪鼻支原体约占所有细胞支原体污染的20-50%。《培养法支原体检测试剂盒》》主要厂家:读者可以根据《中国药典》中收录的培养法支原体检测方法进行操作。二、荧光染色法原理:将待检测样品接种到专门的指示细胞(如:Vero细胞)中,培养一段时间后,用DNA荧光染料(如:Hoechst33258,DAPI)进行染色,如果除了细胞核被染色外,细胞质也有大量的絮状核酸物质被荧光染料染色,那么这些处于细胞质的核酸物质就是支原体DNA。优点:荧光染色法也是我国药典认可的方法之一。缺点:(1)该方法灵敏度太低,当检测成阳性时,细胞经常已经严重污染;(2)需要用到专门的指示细胞(如:Vero细胞),如果不用指示细2/3胞而直接对目标细胞进行荧光染色,由于每种细胞繁殖和吸附支原体的能力差异极大,检测的准确性将比用Vero等指示细胞进行检测要低得多;(3)该方法严重依赖实验人员的经验,可重复性较差。《荧光染色法支原体检测试剂盒》主要厂家:读者可以根据《中国药典》中收录的荧光染色法支原体检测方法进行操作。三、PCR法原理:设计支原体特意的引物,进行PCR扩增。优点:(1)快速,往往只需几小时;(2)可检测的支原体种类较多;(3)目前,该方法是细胞培养液中支原体污染检测的常规方法之一。缺点:(1)整个过程大约需要3个小时;(2)由于细胞培养数天后,培养液中经常含有严重抑制PCR扩增的代谢物,所以样品的前处理一般是PCR法不可或缺的环节;(3)PCR产物的电泳,需要用到EB等潜在的致癌物质;(4)需要用到PCR仪、电泳槽、凝胶成像仪、离心机等仪器;(5)存在假阳性和假阴性。《PCR法支原体检测试剂盒》主要厂家:(1)Sigma公司的LookOutMycoplasmaPCRDetectionKit(货号:MP0035),价格:价格:3469元/24次;(2)上海易色医疗科技有限公司的《PCR法支原体检测试剂盒》,货号:PM008;价格:1000元/100次;(3)以色列BiologicalIndustries(BioInd)公司的EZ-PCRMycoplasmaTestKit,货号:20-700-10,价格:约1000元/10次。四、RD-RCA恒温扩增法原理:这个是上海易色医疗科技公司依托其RD-RCA恒温扩增技术开发的支原体检测产品,产品名称:《一步法恒温支原体检测试剂盒》。该产品非常具有特色,详细原理可以访问其网站了解。优点:《一步法恒温支原体检测试剂盒》使用独特的RD-RCA恒温基因扩增技术,彻底解决了上述PCR法的缺点:(1)整个检测过程只需1小时,大大缩短了检测时间;(2)细胞培养液中的PCR抑制剂,不会抑制该产品的恒温基因扩增,所以任何情况下都无需样品的前处理;(3)恒温基因扩增的灵敏度是PCR法的10-1000倍,检测只需使用1μL的细胞培养3/3液,无需样品的离心浓缩或者进行支原体DNA的抽提;(4)恒温基因扩增的产物无需电泳,可以通过指示剂的颜色变化直接肉眼判断反应结果;(5)无需用到PCR仪、电泳槽、凝胶成像仪、离心机等仪器,整个检测过程只需一个水浴锅。缺点:该产品只能保证认识最常见的污染细胞的13种支原体,虽然这13种支原体大约占污染细胞的支原体种类的99%左右。但是,不排除《一步法恒温支原体检测试剂盒》无法识别个别在体外细胞培养中出现概率极低的支原体。《RD-RCA恒温扩增法支原体检测试剂盒》主要厂家:据笔者了解,目前只有上海易色医疗科技公司生产《一步法恒温支原体检测试剂盒》,货号:MD001,价格大约15-19元/次五、酶活法原理:通过检测支原体特异性ATP合成相关酶的活性。优点:(1)支原体识别率高,100多种支原体,只有1种不能识别,而不能识别的这种支原体几乎不会出现在体外培养的细胞中;(2)可以区分支原体的死活;(3)不存在假阳性和假阴性;(4)检测时间短,整个检测过程只需25分钟。缺点:需要用到具有发光检测功能的多功能酶标仪或独立的发光检测仪。《酶活法支原体检测试剂盒》主要厂家:(1)上海易色医疗科技有限公司的《发光法支原体检测试剂盒》,货号:LM009;价格:1250元/50次。(2)Lonza公司的MycoAlertPlusMycoplasmaDetectionKit,货号:LT07-710;价格:大约10000元/100次。总结:以上每种支原体检测方法各有优缺点,大家应该根据自己试验的需要和实验室条件进行选择。此外,作为支原体检测领域的共识,单独使用目前市面上的任何一种支原体检测试剂盒和检测方法,都无法做到100%正确,既不会漏检(假阴性),也不会多检(假阳性)。严格的支原体检测,至少需要使用两种,最好使用三种不同原理的支原体检测方法同时进行检测,才能使检测结果接近100%正确。
本文标题:细胞支原体污染常用支原体检测方法和试剂盒介绍
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