药物代谢-LCMS在药物分析中的应用-代谢产物鉴定-2016

LC/MS技术原理及应用——药物代谢产物结构鉴定2016-12-32质谱技术与诺贝尔奖Iftheperiodictableisthe“alphabet”ofchemistry,thenmoleculesare“words”,andchemicalreactionsandinteractionsare“sentences”.Oneimportanttooltoobservethelanguageofchemistryisliquidchromatography/massspectrometry(LC/MS).质谱原理简介质谱分析是先将物质离子化，按离子的质荷比分离，然后测量各种离子谱峰的强度而实现分析目的的一种分析方法。以检测器检测到的离子信号强度为纵坐标，离子质荷比为横坐标所作的棒图就是我们常见的质谱图。常见术语质荷比:离子质量(以相对原子量单位计)与它所带电荷(以电子电量为单位计)的比值,写作m/z(mass-to-chargeratio).峰:质谱图中的离子信号通常称为离子峰或简称峰.离子丰度:检测器检测到的离子信号强度.基峰:在质谱图中，指定质荷比范围内强度最大的离子峰称作基峰.总离子流图；准分子离子；碎片离子；多电荷离子；同位素离子6质谱检测回答分析化学中最常见的问题定性-样品中有什么?定量-样品中有多少?MS:MassSpectrometry7质谱仪的特点真空系统样品入口检测器数据系统质量分析器离子源大气atmosphericpressureionization离子源离子生成质量分析器离子分离检测器离子收集8真空对质谱有何重要性？低真空高真空带电离子检测器检测器气体分子离子源910色谱-质谱联用技术接口（离子化方法）GC/MSLC/MS电子轰击离子化EI化学电离离子化CI•正化学电离离子化PCI•负化学电离离子化NCI大气压离子化API:atmosphericpressureionization电喷雾离子化(ESI:electrosprayionization)大气压化学电离离子化(APCI:atmosphericpressurechemicalionization)大气压光电电离(APPI:atmosphericpressurephotoionization)11电喷雾离子化（ESI）过程12大气压化学离子化（APCI）过程13ESI和APCI离子化方式对比1.生成离子的方式不同：ESI：液相离子化；APCI：气相离子化2.样品兼容性ESI：极性化合物和生物大分子APCI：非极性，小分子化合物（相对ESI而言），热稳定，具有挥发性3.流速兼容性ESI-0.001到1ml/minAPCI-0.2到2ml/min4.ESI的适用范围要远远大于APCI5.复杂样品分析时，APCI相对于ESI不易受到基质效应影响14哪种离子化方式？15质量分析器16质量分析器离子阱质量分析器(Iontrap,IT)四极杆质量分析器(Quadrupole,Q)飞行时间质量分析器(Time-of-flight,TOF)扇形磁场和静电场(Sector,E&B)傅里叶变换离子回旋共振(FT-ICR)真空区工作电场或磁场（控制离子的运行轨道）根据m/z不同，实现离子分离17空间上串联质谱全扫描选择离子监测(SIM)产物离子扫描选择反应监测(SRM)母离子扫描中性丢失扫描定量分析三重四极杆串联质谱仪（triple-quadrupole,tandemMS）四极杆18四级杆质量分析器Resolution：Low,unitMassrange:25-2000uScanspeed:4000u/secmaxVacuumrequirement:10-410-5Torr19质量分析器性能指标M.Holˇcapeketal./J.Chromatogr.A1259(2012)3–15分辨率：是指质谱仪分开相邻质量数离子的能力，一般定义是：对两个相等强度的相邻峰，当两峰间的峰谷不大于其峰高10%时，则认为两峰已经分开，其分辨率为其中m1和m2为质量数，且m1m2故在两峰质量数差别越小时，要求仪器分辨率越大20Resolutionexample[Q1]要鉴别化合物A(m/z为235.1077，C12H14N2O3)和B(m/z为235.0713，C11H10N2O4)两个峰，仪器的分辨率至少是多少？21离子阱质量分析器（IT）时间上串联质谱全扫描选择离子监测(SIM)产物离子全扫描选择反应监测(SRM)多级全扫描（n=310)定性分析22离子阱质谱仪（IT）Resolution：Low,unitMassrange:4000uScanspeed:4000u/secVacuumrequirement:10-3Torr23四极杆-飞行时间质谱(Q-TOF)杂交质谱全扫描选择离子监测产物离子扫描准确分子量测定（元素组成）生物大分子检测定性分析24Resolution：highMassrange:unlimitedScanspeed:106u/secVacuumrequirement:10-7Torrorgreater飞行时间质谱仪25质谱扫描模式26扫描模式–FullScan（全扫描）MSModeQ1Q2Q3Fullscan(Q1)Fullscan(Q3)=scanned;=selectedm/z;blank=completetransmission•可获得丰富的谱图信息•复杂样品中成分鉴定27扫描模式–母离子扫描MSModeQ1Q2Q3PrecursorScan=scanned;=selectedm/z;=CID•适合于含有相同局部结构（碎片离子）的一类化合物的鉴定28扫描模式–产物离子扫描MSModeQ1Q2Q3ProductIonScan=scanned;=selectedm/z;=CID•适合于化合物官能团分析以及化合物的结构解析29扫描模式–中性丢失MSModeQ1Q2Q3NeutralLossScan=scanned;=scannedwithoffset;=CID•选择性获取丢失某一固定碎片的化合物信息（鉴定二相结合代谢物）30扫描模式–SIM（选择离子监测）MSModeQ1Q2Q3Selectedionmonitoring(SIM)(Q1)Selectedionmonitoring(SIM)(Q3)=scanned;=selectedm/z;blank=completetransmission•当全扫描无法满足灵敏度的要求时•适合于基质不是很复杂的样品的定量分析31扫描模式–SRM/MRM（选择/多级反应监测）MSModeQ1Q2Q3Selected/Multiplereactionmonitoring(SRM/MRM)=scanned;=selectedm/z;=CIDSRM&MRM•适合于较脏、基质复杂的样品，提高选择性和灵敏度•定量分析32质谱图的样子?33质谱图的样子(APCI/ESI+)34质谱图的样子(APCI/ESI+)35质谱图的样子(APCI/ESI+)36质谱图的样子(APCI/ESI+)37质谱图的样子(ESI+)38质谱图的样子(APCI/ESI)39质谱图的样子(APCI/ESI)(B)[MH],[M-H+CH3COOH]40软电离模式常见前体离子类型41质谱图和色谱图?色谱图?42如果我们注意这个区域...1.251.501.752.002.252.502.753.003.25Time50100%TIC色谱图-放大43在此的细微观察是由许多点组成的...2.122.142.162.182.202.222.242.262.28Time78100%TIC质谱图44每个点相对于质量分析器的一个扫描(质谱图)...60801001201401601802002202402602803000100%240241色谱图上的质谱图45每个点有一张唯一的质谱图数据观察-色谱图样品运行中的每秒我们可获得一张或数张质谱图通常是把检测到的离子叠加在一起获得一个唯一的总的数值这些总的数值然后排列在一起(点对点)产生一个总离子流色谱图(TIC)...46总离子色谱图(totalioncurrent,TIC)47每次扫描加和所有的离子得到...数据观察-色谱图我们也能显示单个离子的色谱图和质谱图这让我们得到一个化合物的信息…48数据观察-选择离子色谱图49TIC图上显示的两个接近的流出峰，每个峰是具有不同质谱指纹的不同化合物...11.0012.00Time0100%TIC1.57e5数据观察-选择离子色谱图50100200300400500600m/z0100%254.2194.2507.3334.3399.7100200300400500600m/z0100%194.2580.4402.2226.2460.211.0012.00Time0100%TIC1.57e5分离共流出物峰5110.5011.0011.5012.0012.50Time0100%0100%0100%254.235.81e4194.206.14e4TIC1.57e5m/z254m/z194TICExtractedionchromatogram(XICorEIC)选择离子色谱图52筛选离子能给出更好的信噪比消除背景影响分离共流出物峰筛选离子也能用于:色谱峰的跟踪准确定量数据观察-选项总离子流色谱图（TIC）观察所有可见峰的最好方法选择离子色谱图（XIC）观察某一化合物的最好方法5354（A）（B）（C）（D）（E）（A）（B）（C）（D）（E）LC/MS不同扫描方式全扫描总离子流色谱图从TIC图中提取离子色谱图产物离子扫描色谱图选择离子监测色谱图选择反应监测色谱图m/z100-500m/z298fromTICMS2ofm/z298SIMm/z298SRMm/z29818055LC/MS在药物代谢研究中的应用药物代谢研究常用的分析技术放射性同位素分析代谢物追踪；组织分布；质量平衡液相色谱-串联质谱分析代谢物发现和表征；多级质谱；高分辨质谱核磁共振分析代谢物对照品结构解析5657LC/MS/MS成为药物代谢研究的主要工具生物样品定量分析LC/MS/MS-三重四极杆LC/UV,免疫分析,其他技术代谢物鉴定LC/MS/MS-三重四极杆-离子阱-高分辨MSNMR和其他技术药物代谢产物鉴定一般流程58产生代谢物分离代谢物检测代谢物药物体外孵化（肝细胞、微粒体、重组酶）；生物样品（动物或人用药后）提取和纯化代谢物，例如通过沉淀蛋白、液液提取、固体萃取和微透析与空白样品色谱对照，检测LC/MS总离子色谱或HPLC/UV色谱中新出现的色谱峰通过中性丢失和前体离子扫描以及通过特征离子检测可能的代谢产物采用LC/高分辨质谱，通过MDF或背景扣除筛选可能的代谢产物液相色谱-放射活性检测器，检测放射标记的代谢产物59表征代谢物药物代谢产物鉴定一般流程比较母体药物和代谢产物的产物离子质谱通过MS/MS或MSn检测结构特征性离子通过测量准确质量确定代谢产物的分子式组成互补性质谱分析（正、负离子切换；不同的电离源）获得代谢产物对照品（合成、体外代谢孵化、微生物转化、生物样品分离提取等）比较色谱保留时间和质谱特征KostiainenR,KotiahoT,KuuranneT,AuriolaS.Liquidchromatography/atmosphericpressureionization-massspectrometryindrugmetabolismstudies.J.MassSpectrom.2003;38:357–372.60代谢反应质量变化C-羟基化+16环氧化+16N-氧化+16N-羟基化+16S-氧化+16/+32P-氧化/羟基化+16/+17甲基化+14乙酰化+42双键还原、羰基还原+2杂原子（O,N,S）去甲基-14氧化脱硫-32葡