禽畜类兽药残留的测定

By兽药（VeterinaryDrugs）•是指用于预防、治疗、诊断动物疾病或者有目的地调节动物生理机能的物质（含药物饲料添加剂），主要包括：血清制品、疫苗、诊断制品、微生态制品、中药材、中成药、化学药品、抗生素、生化药品、放射性药品及外用杀虫剂、消毒剂等。兽药残留(residuesofveterinarydrug)•是“兽药在动物源食品中的残留”的简称，根据联合国粮农组织和世界卫生组织（FAO/WHO）食品中兽药残留联合立法委员会的定义，兽药残留[1]是指动物产品的任何可食部分所含兽药的母体化合物及（或）其代谢物，以及与兽药有关的杂质。所以，兽药残留既包括原药，也包括药物在动物体内的代谢产物和兽药生产中所伴生的杂质。兽药残留的类型•抗生素类：氯霉素、四环素、土霉素、青霉素等；•磺胺类：磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶等；•呋喃类：呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因等；•激素和β-兴奋剂：盐酸克伦特罗、己烯雌酚、孕酮等；•抗寄生虫类：左旋咪唑、苯丙咪唑、克并咪唑、克球酚、吡喹酮等。兽药残留产生的原因•非法使用违禁或淘汰药物；•不遵守休药期规定；•滥用药物；•违背有关标签的规定；•屠宰前用药。•毒性反应•耐药菌株产生•“三致”作用•过敏反应•肠道菌群失调•环境影响•影响畜牧长期食用兽药残留超标的食品后，当体内蓄积的药物浓度达到一定量时会对人体产生多种急慢性中毒。目前，国内外已有多起有关人食用盐酸克仑特罗超标的猪肺脏而发生急性中毒事件的报道。此外，人体对氯霉素反应比动物更敏感，特别是婴幼儿的药物代谢功能尚不完善，氯霉素的超标可引起致命的“灰婴综合征”反应，严重时还会造成人的再生障碍性贫血。四环素类药物能够与骨骼中的钙结合，抑制骨骼和牙齿的发育。红霉素等大环内酯类可致急性肝毒性。氨基糖苷类的庆大霉素和卡那霉素能损害前庭和耳蜗神经，导致眩晕和听力减退。磺胺类药物能够破坏人体造血机能等•动物机体长期反复接触某种抗菌药物后，其体内敏感菌株受到选择性的抑制，从而使耐药菌株大量繁殖；此外，抗药性R质粒在菌株间横向转移使很多细菌由单重耐药发展到多重耐药。耐药性细菌的产生使得一些常用药物的疗效下降甚至失去疗效，如青霉素、氯霉素、庆大霉素、磺胺类等药物在畜禽中已大量产生抗药性，临床效果越来越差•研究发现许多药物具有致癌、致畸、致突变作用。如丁苯咪唑、丙硫咪唑和苯硫苯氨酯具有致畸作用；雌激素、克球酚、砷制剂、喹恶啉类、硝基呋喃类等已被证明具有致癌作用；喹诺酮类药物的个别品种已在真核细胞内发现有致突变作用；磺胺二甲嘧啶等磺胺类药物在连续给药中能够诱发啮齿动物甲状腺增生，并具有致肿瘤倾向；链霉素具有潜在的致畸作用。这些药物的残留量超标无疑会对人类产生潜在的危害•许多抗菌药物如青霉素、四环素类、磺胺类和氨基糖苷类等能使部分人群发生过敏反应甚至休克，并在短时间内出现血压下降、皮疹、喉头水肿、呼吸困难等严重症状。青霉素类药物具有很强的致敏作用，轻者表现为接触性皮炎和皮肤反应，重者表现为致死的过敏性休克。四环素药物可引起过敏和荨麻疹。磺胺类则表现为皮炎、白细胞减少、溶血性贫血和药热。喹诺酮类药物也可引起变态反应和光敏反应•近年来国外许多研究表明，有抗菌药物残留的动物源食品可对人类胃肠的正常菌群产生不良的影响，使一些非致病菌被抑制或死亡，造成人体内菌群的平衡失调，从而导致长期的腹泻或引起维生素的缺乏等反应。菌群失调还容易造成病原菌的交替感染，使得具有选择性作用的抗生素及其他化学药物失去疗效•动物用药后，一些性质稳定的药物随粪便、尿被排泄到环境中后仍能稳定存在，从而造成环境中的药物残留。高铜、高锌等添加剂的应用，有机砷的大量使用，可造成土壤、水源的污染。杨居荣等研究发现，砷对土壤固氮细菌、解磷细菌、纤维分解菌、真菌和放线菌均有抑制作用。WollenbergerL等发现喹乙醇对甲壳细水蚤的急性毒性最强，对水环境有潜在的不良作用。StrongL等报道了阿维菌素、伊维菌素和美倍霉素在动物粪便中能保持8周左右的活性，对草原中的多种昆虫都有强大的抑制或杀灭作用。另外，已烯雌酚、氯羟吡啶在环境中降解很慢，能在食物链中高度富集而造成残留超标•长期滥用药物严重制约着畜牧业的健康持续发展。如长期使用抗生素易造成畜禽机体免疫力下降，影响疫苗的接种效果；还可引起畜禽内源性感染和二重感染；使得以往较少发生的细菌病（大肠埃希菌、葡萄球菌、沙门氏菌）转变成为家禽的主要传染病。此外，耐药菌株的增加，使有效控制细菌疫病变得越来越困难。如根据对广州肉品市场的200例食用猪肝进行病理学分析，68%的猪肝存在着各种各样的病变，病变种类多达25种，不仅有肝细胞的萎缩和各种变性、水肿、囊肿、出血、坏死和钙化等，还发现恶性肿瘤以及见于癌前期或癌症的肝细胞病理性核有丝分裂现象•动物源食品中卡巴氧标示残留物检测方法--------------高效液相色谱法•动物源食品中硝基咪唑类药物残留检测方法------------高效液相色谱法•动物源食品中磺胺二甲嘧啶残留检测方法--------------高效液相色谱法•动物源食品中拉沙洛西钠残留检测方法----------------高效液相色谱法•动物源食品中恩诺沙星和环丙沙星残留检测方法--------高效液相色谱法•动物源食品中噁喹酸和氟甲喹残留检测方法（鸡）------高效液相色谱法•7、动物源食品中噁喹酸和氟甲喹残留检测方法（鱼）------高效液相色谱法•8、动物源食品中苯唑西林残留检测方法（鸡）------------高效液相色谱法•9、动物源食品中青霉素素抗生素残留检测方法（鸡）------高效液相色谱法•10、动物源食品中苯唑西林残留检测方法（牛奶）---------高效液相色谱法•11、动物源食品中氯霉素残留检测方法（牛奶）-----------高效液相色谱法•12、动物源食品中青霉素抗生素残留检测方法（牛奶）-----------微生物法动物性食品中兽药残留检测方法（农牧发[2003]236号）根据《兽药管理条例》规定制定的12种动物性食品中兽药残留检测方法中华人民共和国农业行业标准NY/T753-2012绿色食品禽肉中华人民共和国农业行业标准NY/T843-2009绿色食品肉及肉制品中华人民共和国农业行业标准NY5034-2005无公害食品禽肉及禽副产品兽药残留的分析方法兽药残留的检验分析方法包括筛选、检测和确认。筛选方法微生物检验（微生物抑制试验）免疫法（免疫检测试剂盒）检测和确认方法：理化检验技术【气相色谱法（GC）、高效液相色谱（HPLC）、薄层色谱（TLC）、气相色谱-质谱测定法（GC-MS）、高效液相色谱-质谱测定法等（HPLC-MS）】。GC灵敏度较高，但易出现假阳性、阳性结果需进一步确证；HPLC操作简单，但灵敏度不高；目前灵敏度较高、确证率较好的是GC/MS、GS-MS/MS。畜禽肉中十六种磺胺类药物残留量的测定液相色谱一串联质谱法•检出限：磺胺甲噻二唑为2.5μg/kg，磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺二甲异噁唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺-6-甲氧嘧啶、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺甲基异晤唑为5.Oμg/kg，磺胺噻唑，磺胺甲氧哒嗪、磺胺间二甲氧嘧啶为10.0µg/kg，磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶为20.0μg/kg，磺胺苯吡唑为40.0μg/kg•畜禽肉中磺胺类药物残留用乙腈提取，离心后，上清液用旋转蒸发器浓缩近干，残渣用流动相溶解，并用正己烷脱脂后，样品溶液供液相色谱一串联质谱仪测定，外标法定量。除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水•乙腈：色谱纯。异丙醇。正己烷。乙酸铵。•无水硫酸钠：经650℃灼烧4h，置于干燥器中备用。•流动相：乙腈+0.01mol/L乙酸铵溶液(12+88)。•磺胺醋酰、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲异噁唑、磺胺氯哒嗪、磺胺嘧啶、磺胺甲基异噁唑、磺胺噻唑、磺胺-6-甲氧嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺吡啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺二甲嘧啶、磺胺苯吡唑、磺胺间二甲氧嘧啶标准物质：纯度≥99%；•十六种磺胺标准储备溶液：0.1mg/mL。准确称取适量的每种磺胺标准物质，用甲醇配成0.1mg/mL的标准储备溶液，该溶液在4℃保存，可使用二个月。•基质混合标准工作溶液：根据每种磺胺的灵敏度和仪器线性范围用空白样品提取液配成不同浓度(ng/ml。)的基质混合标准工作溶液，基质混合标准工作溶液在4℃保存，可使用一周。•滤膜：0.2µm。•液相色谱一串联质谱仪：配有电喷雾离子源。•匀质器。•旋转蒸发器•液体混匀器•离心机。•分析天平：感量0.1mg，0.01g。•移液器：1mL，2mL。•鸡心瓶：100mL。•样品瓶：2mL，带聚四氟乙烯旋盖。液相色谱一串联质谱仪液体混匀器鸡心瓶•从全部样品中取出有代表性样品约1kg，充分搅碎，混匀，均分成两份，分别装入洁净容器内。密封作为试样，标明标记。在抽样和制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。•将试样于-18℃冷冻保存•称取5g试样，精确至0.01g，置于50mL离心管中，加入20g无水硫酸钠和20mL乙腈，均质2min，以3000r/min离心3min。上清液倒入100mL鸡心瓶中，残渣再加入20mL乙腈，重复上述操作一次。合并提取液，向鸡心瓶中加入10mL异丙醇，用旋转蒸发器于50℃水浴蒸干，准确加入1mL流动相和1ml正己烷溶解残渣。转移至5mL离心管中，涡旋1min，以3000r／min离心3min，吸取上层正己烷弃去，再加入1mL正己烷，重复上述步骤，直至下层水相变成透明液体。按上述操作步骤制备样品空白提取液。取下层清液，过0.2弘m滤膜后，用液相色谱一串联质谱仪测定。色谱测定•液相色谱条件•质谱条件•a)色谱柱：Lichrospher100RP-18，5µm，250mm×4.6mm（内径）或相当者；•b)流动相：乙腈+0.01mol/L乙酸铵溶液(12+88)；•c)流速：0.8ml/mln；•d)柱温：35℃；•e)进样量：40µL；•f)分流比：1：3。•离子源：电喷雾离子源；•扫描方式：正离子扫描；•检测方式：多反应监测；电喷雾电压：5500V；•雾化气压力：0.076MPa；•气帘气压力：0.069MPa；•辅助气流速：6L/min；•离子源温度：350℃；定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压见表1。上机检测•用混合标准工作溶液分别进样，以工作溶液浓度(ng/mL)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中十六种磺胺的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件和质谱条件下，十六种磺胺的参考保留时间见表2。十六种磺胺混合标准总离子流图参见图A.1和图A.2。•平行试验按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。•空白试验除不称取样品外，均按上述步骤进行。•精密度本标准的精密度数据是按照GB/T6379.1和GB／T6379.2的规定确定的，其重复性和再现性的值以95%的可信度来计算。•重复性在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r，畜禽肉中十六种磺胺含量范围及重复性方程见表3。•再现性在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，畜禽肉中十六种磺胺的含量范围及再现性方程见表3参考文献•中华人民共和国农业行业标准NY/T753-2012绿色食品禽肉•中华人民共和国农业行业标准NY/T843-2009绿色食品肉及肉制品•中华人民共和国农业行业标准NY5034-2005无公害食品禽肉及禽副产品•动物性食品中兽药残留检测方法（农牧发[2003]236号）•GB/T20759畜禽肉中十六种磺胺类药物残留量的测定液相色谱一串联质谱法