细胞凋亡

1Apoptosis细胞凋亡2关于细胞死亡……死亡是生命的普遍现象，但细胞死亡并非与机体死亡同步。正常的组织中也发生细胞死亡，它是维持组织机能和形态所必需的……3一、细胞凋亡及其特性●细胞凋亡，Apoptosis，源自于希腊语，原意是指树叶或花的自然凋落；●细胞凋亡时，就像树叶或花的自然凋落一样，凋亡的细胞散在于正常组织细胞中，无炎症反应，不遗留疤痕。●死亡的细胞碎片很快被巨噬细胞或邻近细胞清除，不影响其他细胞的正常功能。4程序性细胞死亡（programmedcelldeath，PCD）程序性细胞死亡是指细胞在一定的生理或病理条件下遵循自身的程序自己结束生命的过程。病理学上又称为凋亡。对机体发育和维持正常生理功能不可缺少。eg：手足成型、神经系统发育（50%细胞凋亡）、杀手细胞对靶细胞的攻击、细胞更新（人肠和骨每小时10亿细胞凋亡）。5二、凋亡时细胞的主要变化（一）细胞凋亡的形态学改变微绒毛消失脱水空泡化(blebbing)固缩(condensation)出芽(budding)染色质边集(margination)凋亡小体(apoptosisbody)HE×1000，小鼠凋亡肝细胞程序性死亡细胞的形态结构变化9凋亡细胞形态学改变10胸腺细胞正常凋亡11胸腺细胞正常凋亡DNA片段化形成梯状条带DNA以核小体为单位断裂，形成180－200bp或其倍数的片断，电泳时呈特征性梯状条带。DNAladder：鉴定凋亡最可靠方法。（二）细胞凋亡的生物化学变化凋亡细胞DNA链断裂示意图凋亡细胞核酸内切酶将DNA链切断，形成bp数为180bp的整倍数的片断染色体细丝放大后的核小体及其连接DNA电泳结果正常凋亡坏死细胞色素c诱导的凋亡细胞DNA电泳图1．细胞色素c诱导0h2．细胞色素c诱导1h3．细胞色素c诱导2h4．细胞色素c诱导3h5．细胞色素c诱导4h6．阴性对照7．Marker15细胞凋亡的生化改变DNA片断化caspase激活灭活凋亡抑制物水解活性蛋白水解结构蛋白Ca2+/Mg2+Zn2+核酸内切酶激活①②③16ApoptosisNecrosis1.细胞坏死（necrosis)：非正常死亡。2.细胞凋亡（apoptosis)：自然死亡。三、细胞凋亡与细胞坏死17•细胞坏死•是细胞受到急性强力伤害时立即出现的反应。•早期表现为细胞膜破坏，线粒体肿胀。继而溶酶体破裂，细胞内容物流出，引起炎症。1819细胞坏死与程序性细胞死亡2021细胞凋亡与细胞坏死的比较(一)坏死凋亡1.性质病理性，非特异性生理性/病理性，特异性2.诱因强烈刺激，随机发生较弱刺激，非随机发生3.基因调控无有4.生化特点被动过程无新蛋白合成不耗能主动过程有新蛋白合成耗能22细胞凋亡与细胞坏死的比较(二)坏死凋亡5.形态改变细胞肿胀结构溶解，破坏细胞皱缩，核固缩胞膜/细胞器相对完整6.凋亡小体无有7.DNA变化弥散性降解电泳呈均一片状片段化（180-200bp）电泳呈“梯”状条带8.溶酶体改变破裂相对完整9.炎症反应局部炎症反应局部无炎症反应23细胞坏死与程序性细胞死亡比较四、程序性细胞死亡的机理◆2002年的诺贝尔生理学和医学奖授予了在器官发育和程序性细胞死亡研究领域中做出奠基性贡献的3位科学家:●英国的Brenner、Sulston和美国的Horvitz●线虫生命周期短，单个雄虫有1031个体细胞和1000个生殖细胞。其神经系统有302个细胞组成，来自于407个前体细胞，这些前体细胞有105个发生了PCD。●RobertHorvitz等通过体细胞突变的方法发现C.elegans细胞中，有14个基因在凋亡中起作用。雌雄同体的秀丽新小杆线虫26线虫中PCD相关基因●决定死亡的2个基因：ces-1和ces-2基因●执行死亡的4个基因：ced-3、ced-4、ced-9和egl-1基因；●死亡细胞被吞噬细胞所吞噬的7个基因：ced-1、ced-2、ced-5、ced-6、ced-7、ced-8和ced-10；●死亡细胞在吞噬体中被降解的基因:核酸酶基因nuc-1。程序性细胞死亡途径及相关基因●ced-3、ced-4、ced-9和egl-1等4个基因构成了线虫执行死亡的“死亡机器”(deathmachinery);●ced-3和ced-4是细胞杀手;●ced-9可抵消ced-3和ced-4的作用，防止细胞被杀死，因此是存活因子;●真正的细胞杀手是ced-3而不是ced-4。29哺乳动物细胞中有线虫凋亡基因的同源基因•人们发现哺乳类细胞中存在着Ced3的同源物ICE家族（interleukin-1bconvertingenzyme），即Caspase家族，Caspase1催化白介素-1b的活化，即从其前体上将IL-1b切割下来。•在大鼠成纤维细胞中过量表达ICE和Ced3都会引起细胞凋亡，表明了ICE和Ced3在结构和功能上的相似性。30天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶caspase◆自杀性蛋白水解酶即天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶，简称caspase(cysteine-containingaspartatespecificprotease)，半胱天冬蛋白酶;◆caspase的活性位点是半胱氨酸cysteine，裂解位点是天冬氨酸aspartate残基后的肽键。31Caspase活化：◆Caspase自身以非活化的Pro-caspase存在，其激活依赖于其他的Caspase在它的天冬氨酸位点裂解活化或通过自剪接而激活。◆活化的半胱天冬蛋白酶可将细胞内的其它蛋白降解，从而引起apoptosis。目前已经鉴定了10种不同的caspase◆caspase-3、6、7和8在FAS/TNF（肿瘤坏死因子tumornecrosisfactor）介导的程序性细胞死亡途径中起作用；◆caspase-9和3一起参与线粒体Apaf-I、细胞色素c介导的细胞凋亡;32哺乳动物细胞中与线虫同源的凋亡基因•Ced4的哺乳类同源物则迟迟未能发现，直到1997年，才被证明是Apaf-1（apoptosisproteaseactivatingfactor凋亡酶活化因子）。•Ced9的哺乳类对应物则较早地被证明是BCL-2，凋亡抑制因子，能控制细胞色素C的释放。Regulatorsandeffectorsofapoptosis34细胞凋亡的途径胞内和胞外有两条：◆细胞外信号：激活细胞内各级caspase◆细胞内信号：通过线粒体释放细胞色素C，活化凋亡酶激活因子Apaf-1(apoptoticproteaseactivatingfactor-1)激活caspase351胞外信号分子诱导的细胞凋亡途径凋亡信号通路：当细胞接受外界凋亡信号分子(如Fas，TNF等)后，凋亡细胞表面的信号分子受体相互聚集并与细胞内的衔接蛋白(Adaptorprotein)结合；这些衔接蛋白又募集Procaspases聚集在受体部位，Procaspase相互活化并产生级联反应，使细胞凋亡。受体介导的程序性细胞死亡途径Fas相关死亡结构域蛋白(Fas-associateddeathdomain,FADD)TRADD(TNFR1associateddeathdomain)Fas诱导的细胞凋亡•Fas与配体（如TNF）结合发生三聚化，使胞内的DD区与接头蛋白FADD的DD区结合。•FADD激活Caspase-8。38•Caspase-8自剪切活化，激活Caspase-3、6、7。•Caspase可降解结构蛋白、信号蛋白、转录调控蛋白、周期蛋白等等。•Caspase还可降解CAD的调节蛋白，释放出CAD，CAD进入细胞核降解DNA。39•细胞对Fas信号的应答:•I型细胞（typeI），如胸腺细胞，其caspase-8有足够的活性引起细胞凋亡。•II型细胞（typeII），如肝细胞中，Fas介导的caspase-8活化不能达到足够的水平，因此这类细胞中的凋亡信号需要借助凋亡的线粒体途径来放大。40•caspase-8将胞质中的Bid剪切，形成活性分子tBid，tBid进入线粒体，导致线粒体的跨膜电位下降，释放细胞色素c。•细胞色素C激活Caspase-9，后者再激活Caspase-3，使凋亡信号放大。动物细胞中蛋白质酶解级联系统对PCD的介导43能够被下游caspase切割的靶蛋白●蛋白激酶●切割核纤层蛋白，导致细胞核形成凋亡小体；●细胞结构蛋白（如骨架蛋白）●与DNA修复相关的酶类●caspase激活的DNase抑制蛋白。2细胞内源信号诱导凋亡途径●DNA损伤；●细胞质中Ca2+浓度过高；●极度氧胁迫，产生大量的自由基。◆正调控信号（促进细胞死亡）如细胞色素C，凋亡蛋白酶激活因子Apaf◆负调控信号（抑制细胞死亡）如哺乳动物中的BCL-2和BCL-x蛋白。细胞内源信号激发PCD细胞凋亡的大致过程47•研究较多的有bcl-2、c-myc、p53、Ice、Fas/APO-1等。•1、myc•c-myc对增殖和凋亡的调节是一样的。当生长因子持续存在，bcl-2基因表达时，促进细胞增殖，反之细胞凋亡。•Myc蛋白参与诱导细胞凋零。C-myc基因表达失调是多种细胞凋零的主要诱因，细胞凋零依赖于细胞Myc蛋白的含量.•Myc基因的高表达是胚胎胸腺细胞凋零死亡的诱因，如果用反义寡核苷酸阻断C-myc基因的表达，则细胞凋零减弱。五、细胞凋亡相关基因48•2、bcl-2•凋亡抑制基因，存在于线粒体外膜、核膜及部分内质网中。•bcl-2相当于线虫的ced9。•Bcl-2家族可分为两类：一类是抗凋亡的，如：Bcl-2；一类是促进凋亡的，如：Bax、Bad、Bid，以二聚体形体发挥作用。49•3、fas•fas又称作APO-1或CD95，属TNF受体和NGF受体家族。•基因产物为45KD的跨膜蛋白。•Fas蛋白与Fas配体组成Fas系统，二者的结合导致靶细胞走向凋亡。50•4、ICE蛋白酶家族•与线虫ced-3同源，又称为Caspase。•分为ICE和CED-3亚族，前者参与炎症反应，后者参与细胞凋亡。•CED-3家族又分为两类，caspase-8、9能通过自剪接而激活，激活其它caspase；caspase-3、6、7可降解胞内蛋白，引起凋亡，但不能自剪接激活。52•5、Apaf-1•与线虫的ced-4同源；•在线粒体参与的凋亡途径中发挥作用；•能激活Caspase3，这一过程需要细胞色素c和Caspase9的参与。53六、程序性细胞死亡的意义◆动物机体靠对细胞增殖和细胞周期的正负控制以及对程序性细胞死亡的正负控制来维持细胞总数的平衡和机体的生命活力。◆程序性细胞死亡在形态建成中起重要作用。动物细胞数量控制的途径程序性细胞死亡在小鼠脚趾形成中的作用细胞凋亡参与趾的发育•Sculptingthedigitsinthedevelopingmousepawbyapoptosis（Wood2000）57蝌蚪向蛙发育的变态反应中程序性细胞死亡的作用1.去除不需要的结构程序性细胞死亡对发育中神经细胞数量的调节神经细胞过多会导致脑畸形发育59謝謝大家!Deathisonlythebeginning!