基因工程药物制造实例

第十三节基因工程药物制造实例干扰素是真核细胞对各种刺激作出反应而自然形成的一组复杂的蛋白质。干扰素除具有广谱抗病毒活性，还具有抑制细胞分裂，特别是抑制肿瘤细胞生长和免疫调节等功能，作为一种生物活性蛋白有着良好的临床应用价值。干扰素是人体防御系统的重要组成部分。根据分子结构和抗原性的差异分为α、β、γ、ω等4个类型。α型干扰素在分为α1b、α2a、α2b等亚型，其区别仅表现为个别氨基酸。是我国已经批准上市的基因工程药物。早期获得方法：用病毒诱导人白血球(白细胞)产生，产量低，价格贵。300L人血才提取1mg。2003年抗非典期间，江南大学与丽珠集团苏州新宝制药厂合作攻关，通过发酵工程和生物制药工程研制成功了重组人α-2b干扰素口鼻腔喷雾剂，解决了干扰素常温保存稳定性问题。在疫区特殊人群捐赠使用，效果显著。一、基因工程菌的组建诱生的白细胞提取全RNA通过寡dT-纤维素柱蔗糖密度梯度获得寡A的mRNA离心提取12s的mRNA逆转录成cDNA双链cDNA接上dT或dG尾pBR322质粒pBR322质粒加上dA或dC退火获的杂交质粒转化大肠杆菌k12扩增杂交质粒筛选抗四环素但对氨苄用已知干扰素的DNA片断作为青霉素敏感细菌克隆探针挑选富有干扰素cDNA克隆将干扰素cDNA克隆入表达载体在大肠杆菌中进行高效表达二、基因工程干扰素的制备启开种子制备种子液发酵培养粗提精提半成品制备半成品检定分装冻干成品检定成品包装α2b干扰素生产过程1.发酵工程菌：SW-IFNα-2b/E.coliDH5α，质粒用PL启动子，含氨苄青霉素抗性基因。种子培养基含1%蛋白胨0.5%酵母提取物0.5%NaCl。制备种子液作为发酵罐种子使用。发酵培养基：1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，0.05%NaCl，0.01%NH4Cl等。发酵培养基加入氨苄青霉素，防泡剂。30℃发酵8h，然后在42℃诱导2-3h可完成发酵。每隔不同的时间取发酵液，离心称量湿菌体。2.产品的提取与纯化a冷却后离心，除上清液，得湿菌体悬浮于缓冲液中，冰浴条件下超声破碎；b离心，取沉淀部分；加尿素、缓冲液和二巯基苏糖醇溶液溶解。搅拌抽提2h，离心取上清。c加入复性缓冲液，离心，除去不溶物。d超滤器浓缩后，经SephadexG50分离。e经SDS-PAGE检查。f再经DE-52柱纯化。三、质量控制标准和要求⒈半成品检定⑴干扰素效价测定⑵蛋白质含量测定⑶比活性⑷纯度测定⑸相对分子量测定⑹残余外源性DNA含量测定⑺残余血清IgG含量测定⑻残余抗生素活性测定⑼紫外光谱扫描⑽肽图测定⑾等电点测定⑿除菌半成品应做干扰素效价测定、无菌试验、热原试验。⒉成品检定⑴物理性状⑵鉴别试验⑶水分测定⑷无菌试验⑸热原试验⑹干扰素效价测定⑺安全试验一章回顾基因工程技术：将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌(或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。基因表达：结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。融合蛋白真核基因在原核细胞中表达的一种形式，原核多肽和真核蛋白结合在一起。非融合蛋白在大肠杆菌中表达的蛋白质以真核蛋白的mRNA的AUG为起始，在其氨基端不含细菌多肽序列。分泌型表达蛋白真核基因在原核细胞中表达的一种形式，将外源基因融合到编码原核蛋白信号肽序列的下游。质粒的结构不稳定指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。质粒的分裂不稳定指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。包含体是无定形的蛋白质的聚集,不被任何膜所包围，重组蛋白在大肠杆菌中的高表达水平经常导致蛋白聚集而形成不溶、无活性的包含体。如何获得目的基因基因表达的宿主菌有哪些？真核基因在大肠杆菌中表达的形式?酵母细胞作为宿主细胞相对大肠杆菌来说有那些优点？制备基因工程药物的宿主应该满足那些条件？制备基因工程药物的基本过程质粒不稳定的原因？酵母细胞作为宿主细胞相对大肠杆菌来说有那些优点？表达体系产物产生部位培养方式提纯产物活性潜在危性大肠杆菌多肽蛋白质菌体内容易一般对原核好不大融合蛋白质部分高产对真核差酵母多肽蛋白质菌体内容易菌体内真核的接近不大糖基化蛋白外分泌可高产稍复杂天然产物哺乳动物完整外分泌较难成本高简单可达天然需注意糖基化蛋白可高产产物致癌基因工程菌应该满足那些条件？容易获得较高浓度的细胞；能利用易得廉价原料；不致病、不产生内毒素；发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态；容易进行代谢调控；容易进行DNA重组技术操作；产物的产量、产率高;产物容易提取纯化。制备基因工程药物的基本过程获得目的基因组建重组质粒构建工程菌（或细胞）培养工程菌产物分离纯化除菌过滤半成品检定成品检定包装质粒不稳定的原因？⑴含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率，质粒丢失率与宿主菌、质粒特征和培养条件有关。⑵这两种菌比生长速率差异的大小。丢失质粒的菌体在非选择性培养基中一般具有生长优势，在培养中会逐渐取代质粒菌而成为优势菌。提高质粒稳定性的方法影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素实现高密度发酵的方法包含体形成的原因包含体的优势。简述菌体生长与能量的关系基因工程药物的质量控制包括那几个方面？基因工程药物怎样保存？提高质粒稳定性的方法选择合适的宿主菌选择合适的载体选择压力分阶段控制培养控制培养条件固定化影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素⑴外源基因的拷贝数⑵外源基因的表达效率①启动子的强弱②核糖体接合位点的有效性③SD序列和起始密码ATG的间距④密码子组成⑶表达产物的稳定性⑷细胞代谢负荷⑸工程菌的培养条件实现高密度发酵的方法1发酵条件的改进①培养基的选择②建立流加式培养③提高供氧能力2构建出乙酸化能力低的工程化宿主菌3构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌包含体形成的原因主要是高水平表达的结果。在高水平表达时，新生肽链的聚集速率超过蛋白的正确折叠的速率就会导致包含体的形成。重组蛋白在大肠杆菌中表达时，缺乏一些蛋白折叠过程中需要的酶和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等。1、富集目标蛋白：包含体具有高密度，易于分离纯化的优势；2、抗蛋白酶：重组蛋白以包含体的形式存在有效地抵御了大肠杆菌中的蛋白酶对目的蛋白的降解；3、对宿主毒性小：生产那些处于天然构象对宿主细胞有毒害的蛋白有优势。包含体的优势•简述菌体生长与能量的关系•碳源通过有限的呼吸能力所提供的最大能量决定了菌体的最大比生长速率。当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢提供的能量时，由于呼吸链或三羧酸循环的供能不足，菌体会产生乙酸。必须控制菌体生长，从而控制乙酸的产生，减少它的抑制作用。怎样保存基因工程药物？⒈液态保存（1）低温保存：在-10到-20°C以下冰冻保存。（2）在稳定pH条件下保存：调到稳定的pH范围内（3）高浓度保存：在高浓度时比较稳定。（4）加保护剂保存：多元醇、有机溶剂、巯基乙醇2、固态保存含水量降到5%时，在室温或冰箱中保存均比较稳定。长期保存最好方法是制成干粉或结晶。放在干燥器中在4°C可保存相当长的时间。1原材料的质量控制2培养过程的质量控制3纯化过程的质量控制4目标产品的质量控制5产品的保存基因工程药物的质量控制包括那几个方面？转录RNA为DNA的酶（）能降解单链DNA和RNA，打开cDNA双链的发卡结构（）连接3’羟基5’磷酸游离端（）催化一个单核苷酸转移到一个DNA分子的3’羟基末端（）逆转录酶核酸酶S1T4DNA连接酶末端脱氧核苷酰转移酶获得目的基因的方法（）和（）蛋白质保存在稳定的pH下，pH是指（）pI。目前使用最广泛的制备基因工程药物的宿主菌是（）和（）。逆转录法化学合成法接近大肠杆菌酿酒酵母当菌体生长所需能量（）菌体有氧代谢提供的能量时，菌体会产生乙酸，高密度发酵：指培养液中工程菌的菌体浓度在（）以上，包含体的复性过程中，（）蛋白浓度可以减少中间体形成提高复性率。大于50gDCW/L降低