4 DNA重组技术

第四章重组DNA技术与基因工程1基本概念重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。重组DNA技术与基因工程的基本用途分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源大规模生产生物活性物质设计、构建生物的新性状甚至新物种2基本原理大规模生产生物活性物质工程细胞基因工程蛋白质工程途径工程发酵工程细胞工程分离工程酶酶工程分离工程野生细胞野生细胞生物活性物质基因工程的基本形式第一代基因工程蛋白多肽基因的高效表达经典基因工程第二代基因工程蛋白编码基因的定向诱变蛋白质工程第三代基因工程代谢信息途径的修饰重构途径工程第四代基因工程基因组或染色体的转移基因组工程基因工程的支撑技术核酸凝胶电泳技术核酸分子杂交技术细菌转化转染技术DNA序列分析技术寡核苷酸合成技术基因定点突变技术聚合酶链反应（PCR）技术用于核酸操作的工具酶3重组DNA技术所需的基本条件限制性核酸内切酶DNA连接酶DNA聚合酶核酸酶核酸修饰酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的类型主要特性I型II型III型限制修饰多功能单功能双功能蛋白结构异源三聚体同源二聚体异源二聚体辅助因子ATPMg2+ATPMg2+Mg2+识别序列TGAN8TGCT旋转对称序列GAGCCAACN6GTGCCAGCAG切割位点距识别序列1kb处识别序列内或附近距识别序列下游随机性切割特异性切割24-26bp处DNA连接酶DNA连接酶的基本性质修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键DNA连接酶5‘…G-C-T-C-T-G-C-AG-G-A-G…3’3‘…C-G-A-GA-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHP5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’nicknickDNA连接酶DNA连接酶的基本性质连接多个平头双链DNA分子：5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’5‘…G-C-T-C-A-G-OHP-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-POH-G-A-C-C-T-C…5’T4-DNA连接酶用于基因克隆的载体质粒（plasmid）噬菌体或病毒DNA考斯质粒（cosmid）与噬菌粒人造染色体载体载体的功能及特征载体的功能及特征载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件质粒质粒的构建天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的：pSC1018.8kb拷贝数5四环素抗性标记基因TcrColE16.5kb拷贝数20-30大肠杆菌内毒素标记基因E1RSF2124ColE1衍生质粒氨苄青霉素抗性标记基因Apr质粒质粒的分类人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：高拷贝质粒突变拷贝数控制基因拷贝数1000-3000扩增基因低拷贝质粒来自pSC101拷贝数小于10表达某些毒性基因温敏质粒在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质测序质粒含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinker整合质粒装有整合促进基因及位点便于外源基因的整合穿梭质粒装有针对两种不同受体的复制子便于基因克隆表达质粒装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件探针质粒装有报告基因便于启动子等元件的克隆筛选质粒重要的大肠杆菌质粒载体松弛型复制pBR3224363bpOriginofReplicationROPROISalIBamHITcrPvuIPstIPstIEcoRIClaIHindIIIHindIIBalIAprpBR322：氯霉素可扩增拷贝数50-100/cell用于基因克隆质粒重要的大肠杆菌质粒载体pUC18/19：拷贝数2000-3000/cell用于基因克隆和测序装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记lacZ’BamHIpUC182686bpAprlacZ'oriGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT396452EcoRISstIKpnISmaIXbaISalIPstISphIHindIII质粒质粒DNA的分离纯化氯化铯密度梯度离心法：用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁加CsCl和溴乙锭超速离心过夜在紫外灯下吸取cccDNA稀释沉淀cccDNAproteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的l噬菌体DNAl噬菌体的生物学特性：生物结构l噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体l噬菌体由外壳包装蛋白和l-DNA组成l-DNA全长48502个核苷酸l-DNA上至少有61个基因噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的l噬菌体DNAl噬菌体生物学特性：感染周期E.coli吸附LamB受体注入复制包装裂解考斯质粒与噬菌粒考斯质粒（cosmid）考斯质粒载体的构建：考斯质粒是一类人工构建的含有1978年Collins和Hohn发明构建pHC796400bpTcrlfragmentcosoriAprPstIBamHISalIl-DNAcos序列和质粒复制子的特殊类型的载体cossite-carryingplasmid1.8kb的l-DNA片段+pBR322片段装载范围为31-45kb考斯质粒与噬菌粒考斯质粒（cosmid）考斯质粒载体的特点：能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞装载量大（45kb）且克隆片段具有一定的大小范围能像质粒那样在受体细胞中自主复制重组操作简便，筛选容易不能体内包装，不裂解受体细胞考斯质粒与噬菌粒噬菌粒（phagemidorphasmid）噬菌粒载体的特点：噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体能像M13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞装载量比常规的M13mp系列要大很多（10kb）能像质粒那样在受体细胞中自主复制重组操作简便，筛选容易人造染色体载体细菌人造染色体（BacterialArtificialChromosomesBAC）细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础上构建的，其装载量范围在50-300kb之间如pBACs主要适用于：克隆大型基因簇（genecluster）结构构建动植物基因文库人造染色体载体酵母人造染色体（YeastArtificialChromosomesYAC）YAC载体应含有下列元件：酵母染色体的端粒序列酵母人造染色体的构建：pYAC4CEN4EcoRIURA3TELBamHITELoriAprTRP1ARS1酵母染色体的复制子酵母染色体的中心粒序列酵母系统的选择标记大肠杆菌的复制子大肠杆菌的选择标记YAC载体的装载量为350-400kb用于基因转移的受体菌或细胞各种基因工程受体的特性实验室常用的基因工程受体受体细胞应具备的条件受体细胞应具备的条件限制性缺陷型外切酶和内切酶活性缺陷（recB-，recC-，hsdR-）重组整合缺陷型用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recA-）具有较高的转化效率具有与载体选择标记互补的表型感染寄生缺陷型防止重组细菌扩散污染，生物武器除外各种基因工程受体的特性大肠杆菌遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，重组子稳定适用于外源DNA的扩增和克隆、原核生物基因的高效表达、基因文库的构建，是DNA重组实验和基因工程的主要受体菌产结构复杂、种类繁多的内毒素各种基因工程受体的特性枯草杆菌遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全，生长迅速，培养简单，不产内毒素适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的有效分泌遗传欠稳定，载体受体系统欠完备各种基因工程受体的特性链霉菌抗生素的主要生产者，分子遗传相对操作简便，不产内毒素主要用于抗生素生产菌株的改良遗传不稳定，生长相对缓慢各种基因工程受体的特性酵母菌具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定适用于外源DNA的扩增、克隆以及真核生物基因的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究，是DNA重组实验和基因工程重要的真核性受体菌内源性蛋白产物种类繁多且含量高各种基因工程受体的特性昆虫细胞（家蚕）具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖相对较快，培养成本低廉，遗传稳定适用于真核生物基因的高效表达DNA重组操作系统欠完善各种基因工程受体的特性哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞CHO）与人的亲缘关系近，分子重组表达系统健全，具有合适的糖基化修饰系统适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物的生产，是DNA重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体细胞培养条件苛刻，生长缓慢各种基因工程受体的特性植物细胞（拟南芥菜、烟叶）农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分化，细胞培养简单且成本低廉，具有光合作用适用于高等植物基因表达调控的研究、基因药物的生产，农作物品质的改良遗传操作繁琐4重组DNA技术的操作过程切接转增检DNA的体外重组（切与接）同种内切酶生产的粘性末端的连接同尾酶生产的粘性末端的连接不同粘性末端的连接粘性末端的更换人工粘性末端的连接同种内切酶生产的粘性末端的连接5'5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5'GCTTAAAATTCG5'5'GCTTAA5'5'AATTCG5'退火GCTTAAAATTCG5'GCTTAA5'AATTCGGCTTAAAATTCG5'GCTTAA5'AATTCGT4-DNAligaseGAATTCCTTAAG5'5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5'5'GAATTCCTTAAG同尾酶生产的粘性末端的连接BamHI5'5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'GCCTAGGATCCG5'5'TACTAG5'5'GATCAT5'退火GCCTAGGATCCG5'TACTAG5'GATCATT4-DNAligaseTGATCCACTAGG5'5'GGATCACCTAGT5'TGATCAACTAGT5'BclIGCCTAGGATCCG5'TACTAG5'GATCATTGATCCACTAGG5'5'GGATCACCTAGT不同粘性末端的连接BamHI5'5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'GCCTAGGATCCG5'5'CTGCAG5'GACGTC3'T4-DNAligaseCGATCCGCTAGG5'5'GGATCGCCTAGC5'CTGCAGGACGTC5'PstI3'T4-DNApol切平5'CG5'GCKlenow补平5'GGATCCCTAGGATCC5'CTAGGCGATCCGCTAGG5'5'GGATCGCCTAGC人工粘性末端的连接5‘突出末端5'GCCTAGGATCCG5'5'GCTTAA5'5'5'AATTCGT4-DNAligase5'5'Klenow补平Klenow补平5'GGATCCCTAGGATCC5'CTAGG5'GAATTCTTAA5'5'5'AATTCTTAAGTdTTdTdGTPdCTPGAATTGGGGGGCTTAAAATTCGGGGGGTTAAGGGATCCCCCCCCCTAGGATCCCCCCCCCTAGGGAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGT