应用荧光定量比较Ct值法测定基因相对表达量

值法测定基因相对表达量#魏洁书，杨锦芬**基金项目：教育部2011年博士点基金“基于阳春砂HMGR和DXR基因的萜类化合物代谢调控研究”（编号：20114425120009）；广东省自然科学基金面上项目“基于阳春砂HMGR和DXR基因的萜类化合物生物合成调控研究”（编号：S2011010003717）作者简介：魏洁书，（1987-），女，硕士研究生，主要研究方向：创新中药研究与开发。通信联系人：杨锦芬，（1978-），女，副研究员，主要研究方向：中药次生代谢工程。E-mail:[e-mail]（广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心，岭南中药资源教育部重点实验室（广州中5医药大学），广州510006）摘要：实时荧光定量PCR是一种准确快速的核酸定量分析技术，具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点。比较Ct值法是利用荧光定量PCR测定基因相对表达量常用的方法，运用比较Ct值法进行基因相对表达量的分析，可在确定扩增效率的前提下，对所要测定的样品的目的基因及内参基因同时进行扩增，大大减少实验工作10量，且得到的实验结果比较可靠，是一种经济实用，准确合理的实验方法。本文通过实验操作的具体说明，介绍运用比较Ct值法测定基因相对表达量的关键步骤和技术细节。关键词：荧光定量PCR；比较Ct值法；相对定量；基因表达量中图分类号：Q78915Applicationofreal-timefluorescentquantitativepolymerasechainreactionbasedontheCtvaluecomparisonmethodtodeterminetherelativegenesexpressionWEIJieshu,YANGJinfen(ResearchCenterofChineseHerbalResourceScienceandEngineering,GuangzhouUniversityof20ChineseMedicine,KeyLaboratoryofChineseMedicinalResourcefromLingnan(GuangzhouUniversityofChineseMedicine),MinistryofEducation,GuangZhou510006)Abstract:Real-timefluorescentquantitativepolymerasechainreactionisoneofthenucleicacidquantificationtechniques,withtheadvantagesofhighspecificity,highsensitivity,goodrepeatability,accuratequantization,fastspeedandentireblocking.Ctvaluecomparisonmethodis25thecommonlyusedmethodoffluorescentquantitativePCRdeterminationforrelativegenesexpression.Thetargetgene(s)andreferencegene(s)canbeamplifiedsimultaneouslybyusingCtvaluecomparisonmethodtoanalyzerelativegenesexpression,thustheworkloadoftheexperimentwillbegreatlyreduced,andtheexperimentalresultsaremorereliable.Itisaneconomical,practical,accurateandreasonableexperimentalmethod.Inthispaper,thekeysteps30andtechnicaldetailsoftheCtvaluecomparisonmethodforthedeterminationoftherelativegeneexpressionwillbeintroducedthroughthedescriptionofconcreteoperations.Keywords:FluorescentquantitativePCR;Ctvaluecomparisonmethod;relativequantitative;geneexpression350引言实时荧光定量PCR(real-timefluorescentquantitativepolymerasechainreaction，FQ-PCR)是20世纪90年代发展起来的一种准确、快速的核酸定量分析技术，通过在PCR反应体系中引入一种荧光化学物质，对PCR扩增反应中每一个循环产物的荧光信号进行实时检测，以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生40物学研究中的重要技术[1]。根据荧光类型，FQ-PCR可分为染料类、探针类和引物标记三种。中国科技论文在线其中，染料法以SYBRGreenI染料应用最广泛。SYBRGreenI能与所有双链DNA小沟结合。在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步[2]。45定量分析方法包括绝对定量分析和相对定量分析，绝对定量指的是用已知的标准曲线推算未知的样本的量，可以得到某个样本中基因的绝对拷贝数和浓度；相对定量指的是在待测样本中目标基因相对于另一对照样本量的变化，比较两个或多个不同处理的样本中的基因表达水平的高低变化，得到的结果是比值[3]。相对定量法又分为比较Ct值法、双标准曲线法和比较定量法，本文以SYBRGreen荧光化学法为基础，通过实验操作的具体说明，介绍运50用比较Ct值法测定基因相对表达量的关键步骤和技术细节。1比较Ct值法原理该方法同时扩增目的基因片段和内参基因片段，一般设1-2个内参基因。测得两者的Ct值之差，即△Ct。通过扩增标准曲线判断扩增效率，通过数学公式来计算相对量。比较Ct值法与标准曲线法的相对定量的不同之处在于其运用了数学公式来计算相对量，前提是55假设每个循环增加1倍的产物数量，在PCR反应的指数期得到Ct值来反应起始模板的量，一个循环的不同相当于起始模板数2倍的差异[4]。比较不同待测样品cDNA的△Ct值与对照样品cDNA的△Ct值的变化，即可对未知样品基因相对表达量作出判断，从而对不同处理样品基因表达量差异做出分析。制备标准曲线，确定扩增效率达到90-105%，相关系数达到0.99以上，目的基因和内60参基因的扩增效率基本一致，则可根据目的基因与内参基因Ct值之间的差值来计算目的基因的表达差异。比较Ct值法根据数学推导得出F=2－△△Ct，其中△△Ct=（待测组目的基因Ct值-待测组内参基因Ct值）-（对照组目的基因Ct值-对照组内参基因Ct值），因此，2－△△Ct表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数，使用这一方法可以直接得到的目的基因相对于内参基因的量。652比较Ct值法的特点比较Ct值法是基因表达调控研究中最常用的两种相对定量方法之一。其特点在于，运用了数学公式来计算相对表达量，定量的结果由目的基因和内参基因Ct值之间的差值来反映，因为使用了对照样品，比较Ct值法的相对定量使机体的不同组织以及不同实验处理组之间的基因表达的变化具有可比性。其公式的应用要满足两个条件，一是目的基因与内参基70因要有相近的扩增效率，二是扩增效率要达到最佳（接近于100%），主要通过一系列反应体系与条件的优化来实现[5]。3比较Ct值法的操作步骤3.1引物设计定量实验要求引物的特异性好，避免非特异性扩增干扰目的片段的检测。引物设计原则：75引物长度20bp左右；上下游引物长度差异不超过3bp；GC含量40%~60%，4种碱基均刀分配；上下游引物退火温度差异不超过5℃；不能有大于3bp的反向重复序列或自身互补序列存在；片段长度200bp左右，片段太长会使Ct值延时出现，并过分消耗PCR反应组分，降低PCR反应效率，影响实验结果的准确性。的提取、检测及cDNA模板的制备80RNA的提取最好使用新鲜的植物样品，如果不能及时提取，则应在采样后立即用液氮速冻，-70℃保存。提取后首先进行RNA的完整性检测，将提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，观察到28S、18S两条尖锐的条带，其中28S条带亮度约是18S条带亮度的两倍，表示RNA完整。其次进行纯度检测，将RNA进行OD值检测，OD260/OD280应在1.7~2.0范围内，OD260/OD2302.0表示RNA的纯度高；OD260/OD2801.7表示有蛋白质或酚的污染；85OD260/OD2802.0表示可能被异硫氰酸胍等污染；OD260/OD2302.0表示有小分子及盐的存在。若电泳检测到存在DNA污染，则需在下一步反转录之前去除DNA。RNA的浓度计算：RNA浓度（ng/μL）=OD260×稀释倍数×40。用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，制备cDNA模板要保证所有样本的反转录体系中mRNA起始量相等，反应中将mRNA末端配对引物与随机引物组合使用能增加反转录产物的完整性。903.3内参基因的筛选取不同处理组样品每组2个以上进行内参基因的扩增，满足以下两个条件，方可用做内参基因：其一，各反应内参基因之间△Ct＜1（严谨度较低的情况下可允许△Ct＜3）；其二，内参基因与目的基因之间△Ct＜10。单个内参基因校正可能会产生误差，因此可利用多个内参基因进行校正。953.4定量PCR体系的优化经过PCR反应体系的优化，使扩增效率达到90%-105%，现Bio-Rad公司出售的SsoFastEvaGreenSupermix试剂盒，实验所要添加的只有引物、cDNA模板及水，可以最大程度降低反应变量，减少优化参数，提高实验可重复性和可靠性。对以mRNA为模板的反应而言，Mg2+浓度为4-8mmol/L比较合适[5]，上下游引物0.3-0.5μmol/L，退火温度及模板终浓度根100据具体实验进行优化，扩增的Ct值位于15-30个循环之间比较合适。引物储存时间、引物特异性及结合能力、扩增产物的长度及GC含量、PCR体系中各组分含量、不同样本间DNA聚合酶抑制物的存在情况、退火温度以及循环扩增仪上不同位置的差异等都会影响扩增效率，因此，扩增效率太低时要从这些方面进行优化。一般来说，使用预混液进行实验时，只需要进行引物退火温度的优化。进行温度梯度实验，每个温度做一个NTC（非模板对照），105根据熔解曲线判断引物扩增的特异性，排除引物二聚体和非特异扩增的干扰，确定最佳Tm范围。3.5标准曲线的建立为了验证反应体系的扩增效率，必须建立标准曲线。每条标准曲线至少要有5个浓度梯度，而且每个浓度梯度至少要有3个重复，才能保证标准曲线有良好的线性关系。标准品做110梯度稀释时要讲求技巧，以10倍连续梯度稀释方法为例：取1体积样品原液+9体积稀释缓冲液，得浓度为10-1的模板；取1体积10-1标准品+9体积稀释缓冲液，得浓度为10-2的模板，同理依次稀释10-3、10-4、10-5浓度，共5个浓度梯度，切勿直接把1体积标准品原液加入到不同体积的稀释缓冲液中，而且每一个梯度的稀释液一定要充分混刀，再进行下一个浓度梯度的稀释，这样才能使标准曲线有较高的R2值，线性关系好。一般最高浓度梯度对115应的Ct值应在5-13范围内，选取的5个浓度梯度对应Ct值最佳范围位于10-30个循环，同时被选点的模板浓度范围要包括待