DNA甲基化

表观遗传学第二章DNA甲基化Epigeneticdifferences：monozygotictwins简单地把DNA甲基化理解为“一把锁”，凡是被DNA甲基化标记的部分，大都是需要被“尘封”“监禁”的基因，比如基因组的“捣蛋鬼”—转座子，就是被甲基化这把“锁”管制着，失去管制或管制不严，这些“捣蛋鬼”会在基因组里跳来跳去，把基因组搞得一团糟，会引起很多问题，如肿瘤、精神疾病等。酵母与果蝇基因组中未能检测到任何甲基化CpG，这两种生物并不依赖DNA甲基化的方式来控制基因活性，它们采用其它的机制来达到同一目的。脊椎动物与高等植物普遍利用DNA甲基化作为重要的调控机制。指在DNA甲基转移酶(DNMTs)的作用下，以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体，将甲基添加在DNA分子中的碱基上。常见的DNA甲基化发生在DNA链上的胞嘧啶第5位碳原子和甲基间的共价结合，胞嘧啶由此被修饰为5甲基胞嘧啶(5mC)。DNA甲基化的分子机理内容纲要一、DNA的甲基化二、真核生物的DNA甲基转移酶三、DNA去甲基化四、DNA甲基转移酶抑制剂一、DNA甲基化(1)1.DNA甲基化：在DNA甲基转移酶(DNAmethyltransferase,DNMTs)的作用下，将一个甲基添加的胞嘧啶的5’-碳分子上，形成5-甲基化胞嘧啶(5-methylcytosine)2.胞嘧啶甲基化后产生5-甲基化胞嘧啶能够自发的脱氨基形成胸腺嘧啶(Thymine)：5mC-T3.哺乳动物中，~1%的DNA碱基能够发生甲基化修饰4.DNA甲基化的分布：(1)转座子(2)逆转录病毒衍生的重复序列(3)大多数功能基因的编码区一、DNA甲基化(2)1.DNA甲基化的模式：(1)线虫：无甲基化的胞嘧啶(2)果蝇：极少量的甲基化胞嘧啶，识别模式CpT(主要)vs.CpG(极少)(3)哺乳动物：CpG(~70%)或者CpNpG2.CpG–CytosinephosphateGuanine3.镶嵌的甲基化(mosaicmethylation):基因组中，高度甲基化的部分DNA序列被大的非甲基化DNA序列所分隔开4.难以被DNA修复系统所识别：CG→TG是可遗传的CpG岛的甲基化(1)1.CpG岛：富含CpG区域，长度500~1000bp，GC含量超过55%2.非随机出现：~60%的编码基因的5’UTR区域（转录起始区域）含有CpG岛。3.CpG的含量：(1)CG出现的期望值（百分比）：1/16=6.25%(2)观察值：很少（~1%）(3)原因：CG具有很高的突变率4.C-T转换率是其他碱基对转换率的10-40倍以上5.例如：人类肿瘤细胞中的p53基因，50%的点突变都发生在CpG上。CpG岛的甲基化(2)1.CpG在重复片段以及基因的3’UTR区域能够发生甲基化2.CpG岛通常不被甲基化3.哺乳动物中：26,000-45,000CpG岛。常分布在持家基因和一些组织表达特异性基因的启动子区域4.CpG岛：可以被HpaII酶(C|CGG)切成小片段，因此也叫HTF岛C––5mC––T?Deamination去氨基化反应基因组甲基化的特点：可逆性——许多甲基化位点可以根据细胞活性的要求重新甲基化或去甲基化；组织特异性——不同的组织细胞具有不同的甲基化模式，为基因表达设定程序。异常的甲基化可分为高甲基化和低甲基化，前者指正常组织中不发生甲基化的位点被甲基化，后者是指在正常组织中发生甲基化的位点去甲基化。DNA甲基化的检测A．基因组甲基化水平(MethylationContent)的分析1.高效液相色谱2.高效毛细管电泳法B．候选基因(CandidateGene)甲基化分析1.甲基化敏感性限制性内切酶-PCR/Southern法2.重亚硫酸盐测序法3.甲基化特异性的PCR4.甲基化荧光法(MethyLight)5.焦磷酸测序6.结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法C.基因组范围的DNA甲基化模式与甲基化谱分析1.限制性标记基因组扫描2.甲基化间区位点扩增3.甲基化CpG岛扩增4.差异甲基化杂交5.由连接子介导PCR出的HpaII小片断富集分析6.甲基化DNA免疫沉淀法高效液相色谱HPLC是一种比较传统的方法，是根据DNA或蛋白分子量和构象的不同而使其加以分离。由于在动态相和静态相下分子的光吸收度并不相同而加以定量。随着系统的压强的增加，其分辨率增高。故而能够定量测定基因组整体水平DNA甲基化水平。该方法由Kuo等1980年首次报道。过程是将DNA样品先经盐酸或氢氟酸水解成碱基，水解产物通过色谱柱，结果与标准品比较，用紫外光测定吸收峰值及其量，计算5mC/(5mC+5C)的积分面积就得到基因组整体的甲基化水平。这是一种检测DNA甲基化水平的标准方法。高效毛细管电泳法这是一种利用窄孔熔融石英毛细管来从复合物中分离不同化学组分的技术。其基础是在强电场下不同分子的由于其所带电荷，大小，结构以及疏水性等不同而相互分开。用HPCE方法处理DNA水解产物来确定5mC水平，简便，经济且敏感性高。重亚硫酸盐测序法该方法首先用重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变，PCR扩增所需片段,则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶，最后,对PCR产物进行测序并且与未经处理的序列比较,判断是否CpG位点发生甲基化。此方法是精确度很高，能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态，但需要大量的克隆测序,过程较为繁琐、昂贵。BisulfiteModification测序:非甲基化的C将被测序成T，反链为A结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(combinedbisulfiterestrictionanalysis,COBRA)这种方法对标本DNA行重亚硫酸盐处理及PCR扩增，处理后原甲基化的胞嘧啶被保留，而非甲基化的胞嘧啶变为胸腺嘧啶。随后用限制性内切酶对转化后PCR产物切割的特性以识别原标本DNA的甲基化状况。该方法相对简单，不需预先知道CpG位点及样本序列。甲基化DNA免疫沉淀法(MethylatedDNAimmunoprecipitation,MeDIP)这是一种高效富集甲基化DNA的方法。在该方法中，可与5mC特异性结合的抗体加入到变性的基因组DNA片段中，从而使甲基化的基因组片断免疫沉淀，形成富集。通过与已有DNA微芯片技术相结合，从而进行大规模DNA甲基化分析。该方法简便，特异性高，适合DNA甲基化组学(DNAMethylome)的分析。DNA甲基化位点鉴定的方法DNA甲基化的功能1.DNA甲基化可以引起基因组中相应区域的染色质结构变化，使DNA失去DNA酶的敏感位点和限制性内切酶的切割位点。2.DNA甲基化可使染色质高度螺旋化，凝结成团，失去转录活性。宿主防御模型(TheHostDefenceModel)基因调控模型(TheGeneRegulationModel)宿主防御模型1.转座子的甲基化2.人类基因组~45%的区域是转座子3.高度甲基化，细胞中90%的甲基化CpG位于转座子中4.转座子的活性：对机体非常有害5.宿主防御模型：抑制转座子的活性转座子导致的PEV基因调控模型1.DNA甲基化的主要功能：转录沉默(silencingtranscription)(1)基因的启动子区域通常不被甲基化修饰(2)建立特定的基因表达模式：组织特异性、生殖特异性…(3)基因印记、X染色体失活2.DNA甲基化抑制基因转录的机制：(1)干扰转录因子对DNA元件的识别和结合(2)将转录因子的DNA识别序列转变为阻抑物的识别序列(3)DNA甲基化有利于招募染色质重塑或修饰因子3.DNA甲基化：是转录沉默的结果和维持，而不是原因DNA甲基化抑制基因转录的机制Long-termsilencing直接干扰机制(1)直接干扰机制(2)间接机制Themethyl-CpG-bindingproteinsMeCP1andMeCP2能够与甲基化的DNA结合MeCP2能够招募Sin3a,HDACs，形成复合物，阻遏转录MeCP2二、真核生物的DNA甲基转移酶1.哺乳动物:DNMT1,DNMT3A,DNMT3B，DNMT3L,DNMT22.拟南芥：DRM2,MET1，DNMT2,CMT33.粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa):DIM2,dim-5,RIDDNA甲基转移酶DNA甲基转移酶：系统发育分析哺乳动物的DNA甲基转移酶DNMT1:maintenancemethyltransferasesDNMT3A&DNMT3B:denovomethyltransferases–胚胎移植过程中高表达DNA甲基化与去甲基化DNA甲基化的维持：两种模型PCNA:在染色体上滑动UHRF1：特异性的与半甲基化位点结合表观遗传修饰的重编程配子形成胚胎植入前的发育DNA甲基化：CellMemoryDNA甲基转移酶的功能DNA甲基化的通路：哺乳动物启动子的甲基化(a)未知蛋白质因子X失去，DNMT结合，促使启动子甲基化(b)聚合酶失去，DNMT结合-甲基化(c)某些转录因子招募DNMT到启动子区域，促使甲基化(d)组蛋白甲基转移酶(HMT)招募DNMT…DNA甲基化的通路：拟南芥1.拟南芥中大多数全新甲基化由siRNA介导2.DRM2:denovo;MET1:MaintenanceDNA甲基化：哺乳动物VS植物DNA甲基化的通路：粗糙脉孢菌1.RIP:repeat-inducedpointmutationDnmt11.Dnmt1chip/-:Dnmt1的表达量为正常小鼠的10%；2.低甲基化3.Dnmt1chip/-小鼠出生体重为正常的70%4.80%的小鼠4-8个月内产生淋巴瘤5.癌基因c-myc表达量异常增高Dnmt3b1.小鼠胚胎纤维原细胞中的Dnmt3b失活导致DNA的低甲基化(Hypomethylation)，染色体不稳定，使癌症细胞永生化2.形成有丝分裂染色体桥3.转入Dnmt3b能够恢复表型Dnmt3a&Dnmt3b表达特异性：Dnmt3a:ubiquitous普遍存在Dnmt3b:前额，眼睛Dnmt3a&Dnmt3b对哺乳动物的发育至关重要三、DNA去甲基化1.DNA去甲基化(DNAdemethylation):5甲基胞嘧啶(5mC)替代成胞嘧啶的过程2.两种方式(1)主动去甲基化(ActiveDNAdemethylation)A.BonafidedemethylationB.Indirectdemethylation(2)复制相关的去甲基化(Replication-coupledDNAdemethylation)ActiveDNAdemethylation1.5-甲基胞嘧啶去甲基化酶将5-甲基胞嘧啶水解成胞嘧啶和水2.5-甲基胞嘧啶/DNA糖基化酶将5-甲基胞嘧啶从磷酸二脂键骨架中切除，然后通过内切酶修复5-甲基胞嘧啶/DNA糖基化酶5-甲基胞嘧啶去甲基化酶1.1999年，A549细胞中提取，MBD2；2.需要很高的能量：使O-H键和C-C键断裂之后，再形成C-O键和C-H键3.从热动力学上可行5-甲基胞嘧啶去甲基化酶Bonafidedemethylation+二氧化碳+琥珀酸盐+甲醛+甲醇5-甲基胞嘧啶/DNA糖基化酶1.MBD2b:MeCP2的同源蛋白质把MBPD与绿色荧光蛋白连起来（融合），相当于给MBPD加上了一个荧光标签，可以在显微镜下直接观察和追踪MBD的位置。一般情况下，MBPD-GFP是与基因组上甲基化的DNA结合，在在荧光显微镜下呈现绿色的斑点；在基因组甲基化被清除时，MBPD-GFP就无处可以结合，因此就分散在细胞核内，在显微镜下，原来那些绿色荧光斑点消失，而变成了弥散的绿色。这样通过观察荧光信号的变化来判断基因组甲基化的变化。IndirectdemethylationReplication-coupledDNAdemethylation甲基化酶活性的维持甲基化酶活性被关闭甲基化酶活性被抑制去甲基化酶哺乳动物体内可能存在去甲基化的酶，这种酶可能为一种糖基化酶、核酸内切酶或真正的去甲基化酶。