有关中性单细胞凝胶电泳的总结要点

1、辐射生物剂量：此法适于照后短期内的剂量评价，中性条件优于碱性条件；旁观效应：查阅了许多国外文献，尚无此方法观察旁观效应的研究报道，所以我采用此方法观察了1Gy照后的旁观效应，试验今天上午刚刚结束，结果待分析，粗略看，此法对于旁观效应还是很敏感的，此法的优势在于成本低，操作比较简单。低剂量照射的适应性反映：本实验室的一个相关课题刚刚结提，论文在法医学与特种医学版的军事医学子版已有上传，感兴趣的可以去看。凋亡细胞的观察：看过国外此法作出的凋亡细胞彗星图像，很漂亮，用CASP软件分析后，其曲线呈典型的双峰，而正常细胞为单峰。我的一些教训：观察凋亡细胞最好把电压、电流、和电泳时间均调低，否则，凋亡细胞中的DNA片断跑的太块，荧光下根本看不到凋亡细胞的尾巴。注：我用的是中性条件，20V，200mA,20min,凋亡细胞观察宜选用10V,100mA,10min。2、中性单细胞凝胶电泳步骤：（以淋巴细胞为例）1)淋巴细胞的提取①取各组荷瘤鼠外周血0.2ml,肝素抗凝,加入到等体积淋巴细胞分离液上,3500r/min离心4min。②取中间层淋巴细胞并加入PBS至5ml,1500r/min离心8min。③重复洗涤细胞两次。2)琼脂糖玻片的制备①制好微型电泳槽。②使用两层凝胶法,第一层为100μl0.75%正常熔点琼脂糖凝胶,第二层为75μl0.75%低熔点琼脂糖凝胶和25μl淋巴细胞的混合液。3)细胞裂解、电泳①好的玻片浸入新配的预冷的(4ºC)中性裂解液中裂解1.5h。②取出玻片,用双蒸水浸没漂洗。③将玻片置于0.5%电泳液中先解旋20分钟，然后电泳20min,电压20V，电流200毫安。4)染色用溴化乙啶(2μg/ml)染色。用双蒸水冲去多余染液，滤纸洗去多余水分。5)读片和分析①用荧光显微镜(激发波长515-560nm)观察玻片,每张胶随机抓取100个慧星图像并用数码相机拍照后输入计算机储存。②用CASP软件分析系统分析慧星图像。3、biomed96：lq6688你好，本人也正要做这个实验，预实验做了两次，但什么都没看到，也不知道是什么问题，望指教。铺3层胶，第一层100ul1％regular胶，50度烤干，第二层50000个细胞100ul0.5％低熔点胶，第三层100ul0.5％低熔点胶。裂解液：EDTA100mMNacl2.5MTris(10mM)pH101%TritonX-100裂解1小时解旋液：EDTA1mMNaoH300mMPh13孵育20分钟。电泳40分钟。染色：PI50ug/ml染色15分钟。结果是什么都看不到，好像一点都没染色。lq6688：首先，此试验的生物学原理目前还不是很清楚，Sighn和Olive这两个单细胞凝胶电泳的鼻祖首先提出的中性和碱性条件，中性条件检测双链断裂，而碱性条件检测单链断裂，有人曾提出这是为什么，我查阅了大量文献，国外文献没有具体的说明，国内文献更是人云亦云，所以，目前只能按照大家比较默认的：中性－－双链，碱性－－单链，这不是用软件来区分的，而是你的试验条件决定的，我看了您的裂解液ph10，所以检测结果应是单链断裂。其次，您用的是三层三明治铺胶法，目前多数彗星试验已经少用此法，而是双层法甚至单层灌胶，有人担心双层或单层铺胶的脱胶问题，只要在凝胶的承载载体上做点文章，就解决了！我用的是双层铺胶法，我不知道您的第一层正常熔点胶为什么要烤干，是为了防治脱胶吗？我建议您采用双层法（卖瓜人不说自己的瓜苦，呵呵），这样在实验操作上可以节省时间，不必担心脱胶问题，我做了一年多了，自认为很成熟了，从来没有出现脱胶问题，（我不知道您用的凝胶承载体是什么？）。第三，解旋20分钟应该没问题，但是我认为您的电泳时间过长，当然我不知道您的电泳条件（电压、电流、），我认为20分钟足够了，时间长了一是浪费时间，二是彗星图像不好，不利于分析。第四，因为我用的EB染色，2ug/ml，效果很好，您用PI染色，我可能没有发言权，因为我不知道PI的荧光激发光波长是多少，是否您的荧光条件不对？可以查查文献，这一点您对PI应该比我更了解吧。第五，您的裂解时间有点短了，文献报道，最好不要少于1.5小时。第六，我不知道您用的什么细胞，50000个细胞加入100ul0.5％低熔点胶，是不是细胞太多了，含细胞层的凝胶如果细胞密度过大，即使做出结果，彗星图像过于密集，头尾连接互相影响，无法分析。一般100ul0.5％低熔点胶中含400个细胞就足够了。还有一点，差点忘了，我刚刚做的时候，不会用荧光显微镜，大开了自然光源，其实荧光激发根本不用开自然光源，画蛇添足。只要荧光光路通畅了，物镜会出现特殊的荧光，只要波片上有荧光染色的细胞，它肯定跑不了！biomed96：非常感谢lq6688老师，您的建议很有用。1.我用的是HepG2细胞，我是看了一篇文献，上面说最大可以达到50000个细胞，因为第一次做的时候一个细胞都没见到，我以为是细胞数过少，所以我就加大细胞：（根据您的指导，应该肯定可以排除这个可能性了。2.关于电泳时间，我也是参考文献的，同时该篇文献上建议的电泳条件为15V400mA,但我们实验室的电泳仪电流上不去，只能到100mA，不过参照您的成功经验，这样的条件已经是可以了的吧？3.我烤胶也是按照同一篇文献的：（主要也是为了防止脱胶的问题。因为我开始也试过不烤胶，裂解后捞起来时确实出现了脱胶的问题，所以还得向您请教一下，每层胶铺上以后时怎么处理的？另外，我用的载体是普通的显微镜观察用的载玻片，不知道行不行？4.关于染色的问题，由于我们实验室这个实验做的不多，所以不敢用EB，怕污染了荧光显微镜，根据文献建议的几种燃料，我选择了PI，不过我现在想可能是浓度小了，昨天我上流式用PI单染时，用到了1mg/ml出来结果很漂亮，下面我也会考虑加到PI浓度试一下。不过也可能正如您的提示，我的裂解时间过短，我会首先拉长裂解时间看看的。另外，我配的各种溶液成分是对的吧？5.关于单链，双链断裂的问题，因为我正是想通过这个实验看看我的样品对DNA的损伤情况，或者是说究竟有无损伤？（不知道我这要设计合不合理？敬请指正）如果这样可以的话，是不是我要分别做中性和碱性的实验，再进行判断？6.我观察细胞的时候是把自然光关掉的，所以应该不是这个问题。关于数据分析的问题，是不是我用数码相机拍下了照片就可用CASP了？如果是就太好了，因为我正想去外边联系成像系统和分析软件呢。所以还麻烦您提供下载的链接。再次感谢lq6688老师，希望您能继续指导我的实验。lq6688：SCGE的实验条件尚缺乏标准化，去年曾在美国召开专门会议讨论SCGE的标准化，这都是有文献可查的。您的列解液应该不是问题，只要能够把细胞膜和核膜列解就可以了，1%TritonX-100应该是临用时加的吧，另外我还加了DMSO，也是临用时加的。我觉得您完全可以作中性和碱性两种，这样您的结果就更完美了。三层铺胶法在铺胶后都要加盖片的，目的是使胶平整，凝胶固化后移去盖片，再铺另一层，普通波片表面比较光滑，容易脱胶，文献多用毛玻璃片，应该好一点，但也不能完全避免脱胶，我是将普通波片稍加改良，在波片上人为作出两个小电泳槽，是用很窄的玻璃条封上的，这就看你的功夫了，不过这可是一劳永逸的事，不会脱胶。作出的彗星图像用数码相机拍摄后转入计算机，然后就可以用CASP了，我想你的数码相机已经准备好了吧，我用的是NIKON4500，可以和荧光显微镜配套的。注意，CASP只读.tif扩展名的图像，如果你的相机拍摄的图像可以有.tif格式，就更好了，如果是.jpg格式，那还要在计算机中转换一下，不过很简单。目前国外有很多SCGE的自动成像分析系统，不过，价格也不菲，还是自己用相机拍的好。另外，我还是为你担心一个问题，100ul胶含50000个细胞，出来的彗星图像可能密度太大，每个图像都互相影响，将来无法用CASP分析，除非您的胶铺的很薄，不过，就我的经验，不会很薄吧。下面就是CASP的链接，可以免费下载，使用也很简单，看看说明就可以了，祝你成功！4、qyt：我现在想问的是1.彗星试验的重复性好吗？2.不太明白彗星和流式的组合可以检测到什么？3.我做的是碱性，是不是一定加肌氨酸钠，因为不是很好溶解？4.裂解液，电泳液，中和液有没有必要新鲜配置，因为我的裂解液在冰箱中放置3天后会有结晶，但是加热后会溶解5.我也是按照三层胶铺的，不过每次总是会有脱胶的现象，搞得挺难受的。6.验证试验的阳性对照应该选什么啊？7.不同的细胞的裂解时间应该不同吧，想问的是假如想评价药物，（兽药）应该选什么细胞比较合适啊？我现在做的是vero，不过是看了别人的文献决定的，想听听大家的意见很多问题，3Qlq6688：qyt战友，就我的经验，SCGE的重复性还是不错的，但要做到所有的试剂要同批配制，存放时间不要过长，如我的试验，宁愿累几天，也不要把战线拉的太长，前期准备工作可以按部就班，如（肿瘤接种、给药等），一旦用SCGE的时候，一定在较短时间完成，记得我最累的一天从8点上班，到晚上11点半才回家，中间利用一点时间吃饭。因为裂解液时间长了会结晶，（浓度太高了），正如您所说的。加热磁力搅拌器搅拌后，还可以溶解，但是，还是不宜久存的。电泳液和PBS相对好一点。呵呵，SCGE是一个比较年轻的方法，潜力还没有完全发掘出来，与其它技术结合是必然趋势，就拿血液病来说吧，CD分子已经发现了很多了吧，给药后，用某种药物处理，然后用流式把细胞提取出来，再做SCGE，结果可以看到哪种细胞对该药物敏感，有助于发现该药对哪类白血病敏感裂解液药新鲜配制，SCGE中最难配的是裂解液，每次做的时候都要最先配制，而且用加热磁力搅拌器不停搅拌，同时就可以干别的，完全溶解后再放入冰箱预冷。您的脱胶问题和biomed96战友一样，可以该一下凝胶载体，磨砂玻璃或自制微电泳槽，我用的自制微电泳槽，其实很简单，从不脱胶，另外SCGE最好在避光条件下操作，避免额外DNA损伤。阴性对照不必说了，阳性对照可以旋已知的对所研究药物（或同类药物）极度敏感的细胞，如国外文献报道，用共济失调－毛细血管扩张症患者的淋巴细胞做阳性对照观察辐射或UV对正常人淋巴细胞DNA的损伤作用。不同细胞到底裂解多长时间我还没有看见相关文献，但有文献报道，一般裂解1.5～2小时即可。您用的vero我不知道是什么药物？所以我不便发表意见，不过我觉得先用淋巴细胞比较合适。当然还要看药物的靶细胞是什么。qyt：谢谢回答，你那是不是有comet－FISH的资料啊，你能大概给我解释一下不？比如说方向，检测的目标，还有啊我做的是一个兽药的毒性评价，不象你们做的是人医的，不象你们那么复杂，呵呵不过对我的水平也就比较麻烦了。我现在做的vero是一种动物的细胞，对了，你说的磨砂的玻片是自己整的吧，我买了砂纸，不过自己搞了半天觉得效果不是很好，你说的那种自制的微电泳槽能再详细一点介绍吗？我也学学，3Qlq6688：因为作FISH的成本比较高，所以我没有作，我这有这方面的文献，用不同染色体探针标记后，作SCGE，可以筛选出某种损伤因子（物理因子或化学因子等）的靶染色体是几号染色体。国内可能也有人作过，您可以查一下文献，如果需要，我可以帮你查一些国内此方面的文献。CNKI就可以。毒性评价我觉得您用VERO细胞和淋巴细胞分别作一下，如果单纯发表文章还可以，如果作课题，最好再加一点SCGE以外的指标，结果更全面，更合理，更完美，呵呵。磨砂玻璃片应该可以买到，自己作恐怕太麻烦了，而且作的也不好，和您一样，我当初也是自己作，自己摸索，出来后更有成就感，呵呵，我们实验室以前有人作过，也是脱胶的问题，就半途而废了，后来一个师兄又作SCGE，他走后我又把技术改良了一下，现在觉得比较成熟了。微电泳槽其实也不难作，用普通载玻片，用玻璃刀割出几条2毫米的细条，用这些细小的玻璃条在普通载玻片上粘两个1.5厘米见方的槽，呵呵，微电泳槽就作好了，关键怎么割出那么细的玻璃条，我刚开始怎么也割不出，都要放弃了，后来发现工具不好，如果您要作的华建议您买一把好的玻璃刀，100多元，不算太贵，