FISH法检测生物膜中硝化细菌流程的建立及优化张勇

：*rRNA，E.coli；**cNIT3NIT3；***50mg·mL-1[6]10，80，，。，，，。l0，PCR、，。(fluorescenceinsituhybridization，FISH)、[1]。：,，DNA，。、。FISH，，，、、。11.11。FISH，，，（，215011）：(FISH)。，FISH，：1×PBS；：①：46℃，5h，c(NaCl)55mmol/L；②：46℃，3h，c(NaCl)30～40mmol/L。：；；:X2:A:1674-4829(2009)04-0034-04：2009－05－19：(1979-)，，，，：.EstablishmentofExperimentalConditionsandOptimizationofFluorescenceinsituHybridizationAssayforDetectingNitrifyingBacteriainBiofilmZHANGYong，SONGYin-ling，SHIJun，CHENYuAbstract：Experimentalconditionsoffluorescenceinsituhybridization(FISH)fordetectingnitrifyingbacteriainbiofilmisoptimizedthroughtest.Resultsshowthattheoptimizedpretreatmentandhybridizationconditionsfordetectingnitrifyingbacteriainclude:Samplesaren'tcleanedby1×PBSbeforeheatfixed.Hybridizationconditionsofdetectingnitrifyingbacteriainbiofilmareasfollows:①Nitrobacter:temperatureis46℃,hybridizationtimeis5h,andsodiumchlorideconcentrationintheeluateis55mmol/L.②Nitrosomonas:temperatureis46℃,hybridizationtimeis3h,andsodiumchlorideconcentrationintheeluateis30～40mmol/L.Keywords：Nitrifyingbacteria;Fluorescenceinsituhybridization(FISH);Hybridoptimization22420098EnvironmentalScienceandTechnologyVol．22No．4Aug．2009CCTGTGCTCCATGCTCCGCCTGTGCTCCAGGCTCCGCGATCCCCTGCTTTTCTCC16S,1035-105216S，189-2074055HEXFITCNIT3cNIT3**NSO190(5′-3′)*ω（）／%5′***224(a)，NSO190,2h.(b)NSO190，2h.(c)，NIT3，2h.(d)NIT3，2h.1(100×)1.2，。1.32，3[3－4]。22.199%，，，。7d。2.299%，。2.3，50℃2h[5]，4%（CH2O）20min，(C2H5OH)，50%，80%，99%C2H5OH，3min。。2.4，。。5mm[6]。9μL,1μL，，。，。，。。2.5，48℃。，20min，，。，(CFM-500)，CCD，、。BMP。33.13，10，3。。：：ai1～ai10i。，A=(A1+A2+A3)/3，。3.2：(+++)、(++)、(+)，。44.1，46℃。：，。：。NSO190NIT3/mL39245moLNaCl/mL1818/mL405510%SDS/mL111moLTris-HCl/mLpH=7.22223NIT3NSO1900.5moLEDTA/mL11.245moLNaCl/mL10%SDS/mL112moLTris-HCl/mLPH=7.211(i=1,2,3)Ai=ai1+ai2+……+ai1010FISH3520098051015202530(f)HEXNIT3,5h。(a)FITCNSO190,1h。(b)HEXNIT3,1h。(c)FITCNSO190,3h。(d)HEXNIT3,3h。(e)FITCNSO190,5h。123/A110，+15，++2，+A29，+13，+11，++A314，+15，++3，+/A11155123A28，+10，+，+++A11，+，+++10，+A34+8，++，+++//A41-(a),1-（b）NSO190，NSO190。1－（c）、1－(d)NIT3，NIT3。4.24.2.15ng/μL[7－8]46℃NaCl（NIT3：75mmoL；NSO190：30mmoL），。、，3。（1）2NSO190,NIT3。，1h2－(a)、，2－(b)，，；3h2－(c)，2－(d)、；5h2－(e)，，2－(f)，。2(100×)（2）4。43h，，NSO1903h。（3）5。53h5h，5h，NIT35h。4.2.2，Tm46℃[9]，NSO190，NIT346℃。4.2.3NaCl，，。110]：F×0.5=18.51gM1-18.51gM2（2）：F，%；M1，moL；M2，moL。NSO190c(NaCl)30mmoL，NIT3c(NaCl)75mmoL。NSO1903：c(A1)=20mmoL，c(A2)=30mmoL，c(A3)=40mmoL；NIT33，：c(B1)=55mmoL，c(B2)=75mmoL，c(B3)=95mmoL，3，。⑴3，，3－(c)，3－(e)；3－(b)，3－(d)，，3－(f)。36224(f)HEXNIT3,5h。c(NaCl)=95mmoL(a)FITCNSO190,3h。c(NaCl)=20mmoL(b)HEXNIT3,5h。c(NaCl)=55mmoL(c)FITCNSO190,3h。c(NaCl)=30mmoL(d)HEXNIT3,5h。c(NaCl)=75mmoL(e)FITCNSO190,3h。c(NaCl)=40mmoL123/A18，+，+++，+++A28，+15，++11，+++A319，+，+++4，+/A12123A110，++9，++6，+A217，+++，+++4，+A3，+++12，++14，++//A8C(Nace)=95mmoL3NaCl(100×)（2）NaCl6。6NaCl46℃,3h,c(NaCl)30～40mmol/L。（3）NaCl7。7NaCl46℃,5h,c(NaCl)55mmol/L。5，：（1）1×PBS。（2）：①：46℃，5h，c(NaCl)55mmol/L；②：46℃，3h，c(NaCl)30～40mmol/L。[][1].[J].，2001,19(1):18-21.[2]BONDPL，ERHARTRM，WANNERGJR.Blackall.Identificationofsomeofthemajorgroupsofbacteriainefficientandnonefficientbiologicalphosphorusremovalactivatedsludgesystems[J].ApplEnvironMicrobiol,1999,65(9):4077-4084.[3]AMANNRW，LUDWIGKH，SCHLELFER.Phylogeneticidentificationandinsitudetectionofindividualmicrobialcellswithoutcultivation[J].MicrobiolRev,1995(59):143-169.[4]MOTERA,GOBELUB.Fluorescenceinsituhybridization(FISH)fordirectvisualizationofmicroorganisms[J].MicrobiolMethods,2000(41):85-112.[5]，，，.FISHPCR[J].，2001，9(2)：22-23.[6],,，.FISH[J].，2007，33(1)：22-25.[7]KALMBACHSW,MANZB，BENDINGER.2000InsituprobingrevealsAquabacteriumcommuneasawidespreadandhighlyabundantbacterialspeciesindrinkingwaterbiofilms[J].WatRec,2000（34）:575-581.[8]MANZWU，SZEWZYK.P.ETICXXON,RAMANN.Insituidentificationofbacteriaindrinkingwaterandadjoiningbiofilmsbyhybridizationwith16Sand23SRNA-directedfluorescentoligonucleotideprobes[J].ApplEnvironMicrobio,1993（59）:2293-2298.[9]AMANNRI.Molecularnicrobialecologymanual:InsituidentificationofmicroorganismsbywholecellhybrizationwithRNAtargetedmucleicacidprobes[J].DordrechtKluwerAcademic,1995（6）：1-15.[10]MANZW.InsituanalysisofmicrobialbiofilmsbyRNA-targetedoligonucleotideprobing[J].MethEnzymol,1999（310）:79-91.(）FISH37