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第61卷第4期9916年10月环境科学学报CAATCSENEIIATCRICUMSTANTIAEVol.61,No.4Oet.,1996TTC一脱氢酶活性检测方法的研究周春生尹军(吉林建筑工程学院城建系,长春13。。21)摘要以好氧消化污泥为材料,对影响脱氢酶活性测定的样品前处理、生化培养、酶反应终止剂、三苯基甲膳(T)F萃取剂以及萃取条件等问题进行了系统地研究,进而提出了检测脱氢酶活性的常温萃取测定法.这种方法已在剩余污泥好氧消化处理、生物转盘处理生物制品废水以及陶粒柱反应器低温生物预处理饮用水等研究中应用,效果良好.关镇词:TTC一脱氢酶活性;常温萃取法;好氧消化污泥;生物处理.在脱氢酶活性测定方面,通常采用的人工受氢体主要有TTC、NIT和亚甲基蓝〔`一3〕.其中,研究与应用较多的是TTC一还原法闭,国内科技书刊〔5一月所介绍的脱氢酶活性检测方法,大多与其有关.然而,这种测定方法的最大不足是高温(90C)萃取样品显色液,溶剂蒸发,甚至破塞而溢,致使测定结果不稳定.另外,我们在实验中发现,将原有的TTC一还原法直接引入消化污泥生化活性测定方面,会使显色液颜色消失或出现样品测定值低于样品空白值的反常现象.本文利用间歇式运行中的好氧消化污泥为材料,对影响脱氢酶活性测定的诸因素进行实验研究,进而提出了TTC一脱氢酶活性常温萃取测定法的分析程序,并在污泥消化、生物制品废水处理以及饮用水预处理等研究中应用,其效果令人满意.1材料与方法1.1污泥好氧消化间歇式反应器及运行条件自行设计的间歇式污泥好氧消化反应器用有机玻璃板制成,共设4个反应槽,每个容积为3.5L.反应器运行期间,以恒温水浴法控制污泥消化温度,每个反应槽内由两个多孔石曝气头供氧(兼起污泥搅拌作用).实验污泥采集于长春市两家污水处理场.原污泥经10h重力沉淀后,弃去上清液,作为反应器的实验投配污泥.反应器的运行条件为:(1)消化温度30士1℃;(2)pH自然变化;(3)曝气量135Lh/,使反应器内溶解氧浓度维持在2.0mg/L以上;(4)每夭定时补足蒸发的水分.1.2主要试剂配制方法0.4%TTC溶液取4gTTC(2,3,5一氯化三苯基四氮哇,国外进口,分析纯)溶于少量蒸馏水中,再稀释至IL,贮存于棕色瓶中.第一作者简介:男,41岁,副教授DOI:10.13671/j.hjkxxb.1996.04.0044期周春生等:TTC一脱氢酶活性检测方法的研究6054003020100.0以.0..00.0恻叙督Tris一HCI缓冲液(pH=8.4):称取6.0379Tris(三经甲基氨基甲烷,分析纯,北京化学试剂厂),加入20mL1.0mol/LHCI,再定容至1L.0.36%NaZSO。溶液:取3.69NaZSO3(分析纯,北京化学试剂厂)溶于IL蒸馏水中.TTC标准溶液:称取0.050gTTC定溶于50mL茶色容量瓶中,此溶液即为1mg/LTTC的标准溶液.1.3标准曲线的绘制采用1mg/L的TTC标准溶液制备每mL含l}}l}l20406080100120TF,“g/mL图1TF浓度与其吸光值的关系Fig.1RelationshipbetweeneoneentrationofTFanditsabsorbaneeanditsabsorbaneevalue有20、40、60、50、100、120拼gTTC的系列溶液,然后参照文献图进行TTC还原试验,只是将原有的90℃萃取改为37℃萃取,其标准曲线如图1所示.2结果与讨论2.1样品前处理对脱氢酶活性测定的影响在活性污泥脱氢酶活性测定方面,一般用0.85%的生理盐水洗涤样品飞’〕.本文采用纯水和0.85%的NaCI溶液洗涤同一消化污泥,进行对比分析.结果发现,纯水洗涤的测定效果优于0.85%NaCI溶液,见表1.表1洗涤方法对脱氢酶活性测定的影响Table1Effectofwashingmeth记onthemeasurementofthedehydrogeanseaetivity洗涤次数012345纯水0.85%NaCI0.2360.2340.2750.2400.3160.1970.3430.1680.3490.1600.3500.164由表1可见,用0.85%NaCI溶液洗涤消化污泥,脱氢酶活性测定值随洗涤次数的增加而呈下降趋势.这可能与生理盐水中大量lC一不利于氯化有机物TTC发生解离有关.2.2培养条件对脱氢酶活性测定的影响在相同培养时间(30min)情况下,样品培养体系内TTC还原为TF的速度随培养温度的提高而加快,见图2.考虑到废水生物处理及其污泥消化过程中微生物对环境温度的适应特点,本文认为将样品培养温度控制在37士1℃为宜.在同一温度(37℃)条件下,样品培养体系内TF生成总量随培养时间的延长而增加(图3),而TF生成速度则保持在相对稳定的水平上(由图3数据计算出的TF平均生成速度为59.20士3.67mg/(L·h).可见,样品培养时间的选择范围较宽,在。~90min内取任一时间都可以,一般选择30mi.n在样品培养体系内,pH值变化对TF生成速度有一定影响(图4).从图4可见,当pH值低于7.5时,TF生成速度随pH值升高而加快,当pH值为7.5一8.5时,TF生成速度则保持在较高水平上.因此,分析实验中选用pH一8.4的Tisr一HCI缓冲液,即可保证获得16卷较高的脱氢酶活性检出率.nUC八曰ón曰néUnC乃一hùJ,,ó..…11ifn甘nCU恻叙斟0.600.500.400.300.200.10|ì.|尸|尸划长澎20406080培养时间,min培养温度,℃图2培养温度对脱里酶活性测定的影响Fsg.2Effectofeulturingtem卯ratureonthemeasurementofthedehydrogenaseaetivity图3培养时间与TF生成t的关系Fig.3Relationshipbetweeneulturingtimeandthenum拢rofPr司ueedTF7.07.58.08.pH值图4pH对脱氮酶活性测定的影响Fig.4EffeetofpHonthemeasurementofthedehydrogenaseaetivity.23酶反应终止剂的选择Klapwijk等(1974)采用浓HZSO4作为活性污泥脱氢酶活性测定的酶反应终止剂.但我们发现,加入1滴浓HZSO;会使消化污泥样品培养液的红色变为茶色,致使比色分析无法进行.当选用丙酮进行酶反应终止实验时,则避免了“茶色现象”,说明导致消化污泥脱氢酶活性测定中出现“茶色现象”的成因是浓H2504的加入.这可能与消化污泥自身特性有关.因为消化污泥中,既有内源代谢产物的积累,又有残存的细胞碎片的存在,它们能否被H2504氧化产生颜色反应值得研究.玛嗽督采用甲醛、乙醇、丙酮3种试剂进行相同用量的酶反应终止实验.结果表明,甲醛终止酶反应的效果优于乙醇和丙酮(表2).因此,在测定消化污泥脱氢酶活性时,可采用甲醛作为酶反应终止剂.一般情况下,将甲醛用量控制在样品反应液体积的1/10左右.衰2不同酶反应终止荆的作用效果Table2Funetuionofdifferentter而antingagentoftheenzymereaction比色结果(吸光值)化合物YP一KB脱氢酶活性mg/(L.h)0.0820.1380.1400.6170.6420.6300.5350.5040.490150.44141.58137.38醛醉甲酮乙丙注:KB—样品空白,YP—样品;表中数据为3次测定平均值.24萃取剂的选择采用4种有机化合物进行TF萃取对比实验,测定结果见表3.由表3可见,在甲醇、乙醇、异丙醇以及丙酮中,萃取TF效果最佳者为丙酮.据资料介绍,丙酮具有选择性溶解某些有机物,且在水溶液中能够抑制物质离解的特性阁.因此,选用丙酮作为脱氢酶活性测定的萃取剂,不但萃取效果好,而且有利于萃取液颜色的稳定.4期周春生等:TTC一脱氢酶活性检测方法的研究表34种化合物萃取TF效果的比较Tabel3oCmparisonofextreatingTFbyfoureomPOnuds比色结果(吸光值)组别甲醉0.7100.3940.4050.14乙醇0.6560.3870.3540.364异丙醇0.7000.3850.3480.390丙酮0.8000.4510.4600.4842.5萃取剂浓度对脱氢酶活性测定的影响在37℃条件下,采用不同浓度丙酮水溶液对样品培养液的离心沉淀物进行萃取,结果见表4.表4不同浓度丙酮萃取TF效果比较(mg/(L·h))Table4ComPar一sonofextraetingTFbydifferenteoneentratlonsofaeetone浓度,%组别—10080604020196.52113.9765.0546.5322.912212.96241.69144.9170.9240.513281.77319.49177.9867.7941.43470.0897.2162.7645.5438.15从表4可见,萃取剂浓度不同影响TF萃取效果,但并非纯丙酮萃取TF效果最佳,采用80%的丙酮萃取TF效果较好.这个发现很重要,它预示着变高温萃取为常温萃取TF的可能,也对减少试剂用量、降低分析成本有实际意义.为了进一步验证37℃常温萃取TF的可行性,在两种温度条件下进行了萃取TF的对比实验,测定结果见表5.表5不同萃取温度亲件下测得的脱氮酶活性(mg/(L·h))Table5eDhydrogenaseaetiv一tymeasuredunderd一ferentextraetingtemperarures萃取温度,℃组别—37士190士1143.94145.99145.31130.68125.19140.74140.96136.39111.02116.73122.00123.13从表5可见,37C萃取TF的效果优于高温萃取,它的两组数据的平均值分别为后者的1.15和1.19倍,说明影响萃取TF效果的主要因素并非只是温度作用,萃取剂浓度对萃取TF的影响至关重要.只要对样品培养液进行固液分离,再用有机溶液萃取其沉淀物,即使是在常温条件下进行,也可获得较为理想的测定结果.2.6改进后的脱氢酶活性测定程序及其精度试验采取消化污泥混合液10mL,于400or/min条件下,用纯水离心洗涤3遍,并转移至25mL比色管;向比色管内依次加入7.5mLTris一HCI缓冲液(pH=5.4)、2.5mLNaZSO3环境科学学报16卷溶液(0.36%)、2.5mL纯水以及2.5mCTTL溶液(0.4%),混匀,并从中吸取5mL于离心管内,加0.5mL甲醛固定以作样品空白;将25mL比色管于37士1℃条件下水浴振荡培养30min,然后向管内加2.0mL甲醛终止酶反应;将样品培养液以5.5mL为1份分装于4个离心管中,连同样品空白对照管一道离心5min,弃去上清液;向各离心管内加5mL丙酮,研磨搅拌混合,于37℃条件下萃取TF10min后,进行离心5min;用1cm的比色皿取上清液(显色液),于波长485nm处进行比色,记录吸光值;根据样品显色液与样品空白的吸光值之差,查标准曲线,进而计算出TF的生成速度,即脱氢酶活性(mg/(L·h)).采用本文所提出的改进方法,对同种消化污泥样品进行8次重复试验,其测定结果的平均值为69.5775,标准偏差为士1.3535,变异系数为1.945.可见,改进方法的重复试验精度比较理想.2.7检测方法应用实例在剩余污泥好氧消化研究方面,脱氢酶活性指标具有替代常用指标OUR(氧摄取速率)的可能.对处理含酚废水的剩余活性污泥,于20士1℃条件下好氧消化21天,此间共取样22次,同时测定TTC一脱氢酶活性、MLSS(混合液悬浮固体浓度)和OUR.结果表明,TTC一脱氢酶活性与OUR之间具有显著的相关性(r一0.9518,n一22),已超过了文献[3]报道结果的相关水平(r一0.83,n一9).对一组高浓度污泥(初始MLss浓度为2029
本文标题:TTC脱氢酶活性检测方法的研究周春生
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