厨余垃圾高温堆肥中嗜热细菌种群结构分析杨朝晖

中国环境科学2007,27(6)：733~737ChinaEnvironmentalScience厨余垃圾高温堆肥中嗜热细菌种群结构分析杨朝晖*,刘有胜,曾光明,肖勇,杨恋(湖南大学环境科学与工程学院,湖南长沙410082)摘要：基于16SrDNA的PCR-变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术和系统发育分析,对厨余垃圾高温堆肥中嗜热细菌种群结构进行研究.堆肥高温阶段(50℃)持续7d,在此期间从堆体中采样并提取微生物总DNA,使用细菌通用引物GC-341F/907R从总DNA中成功PCR扩增出目标16SrDNA片段,对扩增16SrDNA进行DGGE分析,DGGE条带相似性Cs值分析和切胶测序,使用序列数据进行同源性分析并建立系统发育树.DGGE和相似性Cs值分析结果表明,堆肥高温阶段有着比较丰富的细菌多样性,同时存在明显的优势种群结构变化;切胶测序和系统发育分析结果表明,大部分高温阶段优势种群序列与芽孢杆菌属(Bacillus)和梭菌属(Clostridium)中的嗜热菌群具有较近的亲缘关系.关键词：厨余垃圾；高温堆肥；变性梯度凝胶电泳(DGGE)；嗜热细菌；系统发育分析中图分类号：X172文献标识码：A文章编号：1000-6923(2007)06-0733-05Analysisofthermophilicbacterialcommunitiesstructureinhightemperaturecompostingofkitchenwaste.YANGZhao-hui*,LIUYou-sheng,ZENGGuang-ming,XIAOYong,YANGLian(CollegeofEnvironmentalScienceandEngineering,HunanUniversity,Changsha410082,China).ChinaEnvironmentalScience,2007,27(6)：733~737Abstract：Usingbaseonthepolymerasechainreaction(PCR)of16SrDNA-denaturinggradientgelelectrophoresis(DGGE)techniqueandphylogeneticanalysis,thethermophilicbacterialcommunitiesstructureinhightemperaturecompostingofkitchenwastewasstudied.Thecompostinghigh-temperaturestage(50)℃continued7days,inthisperiod,samplingstackbodyandcollectingmicrobialtotalDNAoftheobject,16SrDNAfragmentswereamplifiedusinguniversalbacteriaprimers(GC-341F/907R).TheDGGEanalysiswascarriedoutonamplificationof16SrDNA.TheDGGEtwigbeltsimilarityCsvalueanalysisandcutgluesurveyorder,usingorderarrangedatatocarryoutsamesourcepropertyanalysis,andsystemphylogenetictreewasestablished.TheanalysisresultsofDGGEandsimilarityCsvalueshowedthatthecompostinghightemperaturestagehadmorerichbacteriadiversityandexistedobvioussuperiorcommunitystructurechange.TheanalysisresultsofcutsurveyorderandphylogeneticshowedthatlargepartofhightemperaturestagesuperiorcommunityorderarrangepossessednearerbloodrelationwithBacillusandClostridium.Keywords：kitchenwaste；hightemperaturecomposting；denaturinggradientgelelectrophoresis(DGGE)；thermophilicbacteria；phylogeneticanalysis厨余垃圾属于易腐性有机垃圾,有机物含量高、含水率高、热值低.高温堆肥化处理是一个重要途径.堆肥高温阶段是木质素、纤维素和半纤维素等分子产生破坏、断裂和分解的主要阶段,也是有机质高效降解的主要阶段.同时在堆肥高温阶段,堆肥中绝大部分的寄生虫、虫卵、孢子和病原菌等被灭活,是保证堆肥无害化的重要阶段.因此,研究堆肥高温阶段嗜热细菌的种群结构及多样性,对于加快堆肥过程中有机质降解、缩短堆肥周期具有重要意义.研究表明,可培养微生物仅占自然界微生物的0.1%~10%[1],因此传统纯培养方法无法全面反映微生物多样性的原始状态[2].随着分子生物学和系统发育分析方法的发展,基于16SrDNA基因的分子生物学方法逐渐被用来分析复杂的生态系统[3-5].目前,聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术已逐渐运用于研究农田土壤[6-7]、活性污泥[8]、生物膜[9]中的微生物多样性.本试验运用PCR-DGGE技术和系统发育分析研究厨余垃圾堆肥高温阶段嗜热细菌种群结构和多样性动态变收稿日期：2007-02-08基金项目：国家“973”项目(2005CB724203);国家自然科学基金资助项目(50478053);湖南省自然科学基金资助项目(04JJ3004,05JJ2004)*责任作者,教授,[e-mail]734中国环境科学27卷化,为厨余垃圾堆肥过程中接种优势种群,加快堆肥过程、缩短堆肥周期提供理论依据.1材料与方法1.1堆肥材料与处理从某大学食堂采集的厨余垃圾16kg,与4kg木屑、4kg土壤混合于约30L的简易堆肥装置中,将堆肥装置移至恒温室,保持温度为30.℃每3d进行1次翻堆.堆肥持续18d,每天取样,取样点分布于堆体4个不同的位置,分别取样后混合.编号分别为1~18.并实时测量温度、pH值、含水率等参数.采集的样品于−20℃冰箱保存待分析.1.2堆肥样品总DNA的提取与PCR扩增称取1g堆肥样品,采用蛋白酶K-CTAB法[10]进行总DNA的提取,纯化采用异丙醇沉淀法.纯化后的总DNA进行PCR扩增,扩增引物采用细菌通用引物GC-341F[3-5,11]和907R[5].1.3DGGE分析PCR扩增产物使用1%琼脂糖进行凝胶电泳,目的条带用QIAquikGelExtractionKit(Qiagen,Germany)回收,溶解于60µL无菌Milli-Q水中.取30µL纯化后的PCR产物在DCodeSystem(Bio-Rad,USA)上进行电泳分离,电泳条件为凝胶变性梯度35%~65%,电泳缓冲液为1×TAE,电压140V,电泳温度60,℃电泳时间16h.经EB染色后用GelDoc2000凝胶成像系统(Bio-Rad,USA)观察结果并拍照.1.4DGGE图谱相似性分析通过比较相似性系数(Cs)分析堆肥高温阶段指纹图谱的相似性[12-13],Cs值变化范围为0~100.Cs=2j/(a+b)×100式中:a,b分别代表堆肥不同天数较清晰的DGGE条带数目;j指a,b中共有的条带数目.1.5切胶测序和系统发育分析在紫外灯下切下DGGE条带,洗净后于60µL无菌Milli-Q水中浸泡24h以上,取20µL进行PCR扩增,扩增产物经DGGE确认为单一条带后,送交生物公司(上海Sangon)测序.测序结果提交GenBank并获得接受号.使用GenBank的BLAST对测序结果进行同源性分析,根据同源性分析结果使用DNAStar5.0分析软件建立系统发育树.2结果与分析2.1厨余垃圾堆肥处理堆肥原料含水率为54.6%,pH值为6.7,有机质含量(干重)为36.64%,C/N为30.01,堆肥处理18d过程中高温阶段(50)℃为7d,分别为第7d(53)℃、第8d(56)℃、第9d(58)℃、第10d(64)℃、第11d(61)℃、第12d(57)℃、第13d(52).℃2.2高温阶段堆肥样品总DNA的提取与PCR扩增高温阶段堆肥样品中提取出基因组总DNA,长度在23kb左右.PCR扩增产物片段长度约为630bp,无明显非特异性扩增,各个样品的扩增产物均可作为变性梯度凝胶电泳.2.3DGGE指纹图谱结果与Cs值分析在GelDoc2000凝胶成像系统下,使用QuantityOneV4.52(Bio-Rad,USA)软件对DGGE凝胶进行成像,在7条泳道上共观察到32条不同的条带(图1a).图1b是凝胶成像系统的成像照片经过软件分析和人工分析后绘制的DGGE图谱示意,简单描述了各条带的相对强度和分布.堆肥高温阶段(7~13d)Cs值分析结果见表1.由DGGE图谱(图1a)可见,堆肥高温阶段各时期细菌16SrDNA序列使用PCR-DGGE分析得到了较好的分离,条带位置清晰,亮度明显.在高温阶段不同时期存在各自的优势条带:第7d的条带t,第8d的条带p、A,第9d的条带b、i、p、A,第10d的条带p、A,第11d的条带f、h、m、o、A、D、F,第12d的条带w、A、D、F,第13d的条带p、A.条带p、A、D、F几乎存在于堆肥的整个高温阶段,基本属于各时期的优势条带,说明它们代表的嗜热细菌在52~64℃内均比较适宜生长.条带b、d、f、h、k、o、u、v、t只存在于某个单一的高温时期,说明这些条带所代表的嗜热细菌只有相应的温度才适宜生长.由Cs值(7~13d)分析结果(表1)可见,高温阶段各时期之间的相似性Cs值均6期杨朝晖等：厨余垃圾高温堆肥中嗜热细菌种群结构分析735较低,Cs值昀高为79(泳道10,12),昀低为29(泳道8,11),其余Cs值均在30~77之间.这说明高温阶段温度变化过程中存在比较明显的嗜热细菌群落动态变化.13121110987a.DGGE图谱7910111213defghijklmnopqrstuvwxyzABCDEFabc8b.DGGE条带强度图1DGGE图谱和DGGE条带强度示意Fig.1DGGEpatternsandDGGEbandintensity2.4嗜热细菌系统发育分析DGGE图谱(图1a)中15条优势条带经切胶回收、PCR重扩增和DGGE鉴定后,测序,共获得15条不同的16SrDNA序列,使用GenBank的Sequinwin32将序列一次性提交给GenBank,并获得接受号(EF396148~EF396162),条带与接受号之间的对应关系见表2.将15条序列与GenBank数据库中的序列进行比对,获得同源性信息(表2),并下载与其同源性昀近的序列,使用DNAStar5.0程序中的ClustalV方法建立系统发育树(图2).表1DGGE图谱相似性Cs值分析Table1ThepairwisesimilaritycoefficientofDGGEprofileCs值堆肥时间(d)7891011121378910111213100715040343535711005745293040505710048364452404548100557971342936551005959353044795910077354052715977100表215条序列的BLAST结果Table2Resultsof15sequencesusingBLAST比对序列编号接受号接受号物种名同源性(%)bEF396148AB004913Symbiobacteriumthermophilum96.7fEF396150