固相萃取液相色谱串联质谱法测定猪栏废水中10种抗生素

书书书固相萃取液相色谱串联质谱法测定猪栏废水中１０种抗生素闾　幸１，２，余卫娟３，兰亚琼２，李　立２，叶朝霞３，刘　锐２，陈吕军２，４，张永明１（１．上海师范大学生命与环境科学学院，上海２００２３４；　２．浙江清华长三角研究院生态环境研究所，嘉兴３１４００６；　３．嘉兴市环境保护监测站，嘉兴３１４０００；　４．清华大学环境学院，北京１０００８４）摘　要：应用固相萃取液相色谱串联质谱法测定养猪废水中１０种抗生素的含量。水样由盐酸调节ｐＨ至２．５～４．０，流经ＯａｓｉｓＨＬＢ固相萃取柱富集后再用甲醇洗脱。以ＡｇｌｉｅｎｔｅｃｌｉｐｓｅＸＤＢＣ１８色谱柱为分离柱，以不同体积比的０．１％（体积分数）甲酸溶液和乙腈混合液为流动相进行梯度洗脱，采用电喷雾正离子源多反应监测模式检测。１０种抗生素在一定的质量浓度范围内与其峰面积呈线性关系，方法的检出限（３Ｓ／Ｎ）在０．０３～３．５μｇ·Ｌ－１之间。加标回收率在５３．２％～１０４％之间，测定值的相对标准偏差（狀＝６）在０．５％～６．３％之间。关键词：液相色谱串联质谱法；猪栏废水；抗生素；固相萃取中图分类号：Ｏ６５７．６３　　　文献标志码：Ａ　　　文章编号：１００１４０２０（２０１４）０３０２７３０５犔犆犕犛／犕犛犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳１０犃狀狋犻犫犻狅狋犻犮狊犻狀犛狑犻狀犲狉狔犠犪狊狋犲犠犪狋犲狉狑犻狋犺犛狅犾犻犱犘犺犪狊犲犈狓狋狉犪犮狋犻狅狀犔犡犻狀犵１，２，犢犝犠犲犻犼狌犪狀３，犔犃犖犢犪狇犻狅狀犵２，犔犐犔犻２，犢犈犣犺犪狅狓犻犪３，犔犐犝犚狌犻２，犆犎犈犖犔ü犼狌狀２，４，犣犎犃犖犌犢狅狀犵犿犻狀犵１（１．犆狅犾犾犲犵犲狅犳犔犻犳犲犪狀犱犈狀狏犻狉狅狀犿犲狀狋犪犾犛犮犻犲狀犮犲，犛犺犪狀犵犺犪犻犖狅狉犿犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔，犛犺犪狀犵犺犪犻２００２３４，犆犺犻狀犪；２．犐狀狊狋犻狋狌狋犲狅犳犈犮狅犾狅犵犻犮犪犾犈狀狏犻狉狅狀犿犲狀狋，犢犪狀犵狋狕犲犇犲犾狋犪犚犲犵犻狅狀犐狀狊狋犻狋狌狋犲狅犳犜狊犻狀犵犺狌犪犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔，犑犻犪狓犻狀犵３１４００６，犆犺犻狀犪；３．犑犻犪狓犻狀犵犈狀狏犻狉狅狀犿犲狀狋犪犾犘狉狅狋犲犮狋犻狅狀犪狀犱犕狅狀犻狋狅狉犻狀犵犛狋犪狋犻狅狀，犑犻犪狓犻狀犵３１４０００，犆犺犻狀犪；４．犛犮犺狅狅犾狅犳犈狀狏犻狉狅狀犻犮狊，犜狊犻狀犵犺狌犪犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔，犅犲犻犼犻狀犵１０００８４，犆犺犻狀犪）犃犫狊狋狉犪犮狋：ＬＣＭＳ／ＭＳｗａｓａｐｐｌｉｅｄｔｏｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆ１０ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓｉｎｓｗｉｎｅｒｙｗａｓｔｅｗａｔｅｒｗｉｔｈｓｏｌｉｄｐｈａｓｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ．ＴｈｅｗａｔｅｒｓａｍｐｌｅｗａｓａｃｉｄｉｆｉｅｄｔｏｐＨ２．５ｔｏ４．０ｗｉｔｈＨＣｌ，ａｎｄｅｎｒｉｃｈｅｄｂｙｐａｓｓｉｎｇｔｈｒｏｕｇｈＯａｓｉｓＨＬＢＳＰＥｃｏｌｕｍｎ．Ｔｈｅｃｏｌｕｍｎｗａｓｅｌｕｔｅｄｗｉｔｈｍｅｔｈａｎｏｌ．ＦｏｒＬＣｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，ａｇｌｉｅｎｔｅｃｌｉｐｓｅＸＤＢＣ１８ｃｏｌｕｍｎｗａｓｕｓｅｄａｓｓｔａｔｉｏｎａｒｙｐｈａｓｅ，ａｎｄｔｈｅｍｉｘｔｕｒｅｏｆ０．１％（φ）ｆｏｒｍｉｃａｃｉｄｓｏｌｕｔｉｏｎａｎｄａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅｍｉｘｅｄｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｒａｔｉｏｗａｓｕｓｅｄａｓｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅｉｎｇｒａｄｉｅｎｔｅｌｕｔｉｏｎ．ＥＳＩ＋ａｎｄｍｕｌｔｉｒｅａｃｔｉｏｎｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇｗｅｒｅａｄｏｐｔｅｄｉｎＭＳ／ＭＳ．Ｌｉｎｅａｒｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓｂｅｔｗｅｅｎｖａｌｕｅｓｏｆｐｅａｋａｒｅａａｎｄｍａｓｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅ１０ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓｗｅｒｅｋｅｐｔｉｎｄｅｆｉｎｉｔｅｒａｎｇｅｓ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｌｉｍｉｔｓ（３Ｓ／Ｎ）ｆｏｕｎｄｗｅｒｅｒａｎｇｅｄｆｒｏｍ０．０３ｔｏ３．５μｇ·Ｌ－１．Ｖａｌｕｅｓｏｆｒｅｃｏｖｅｒｙｆｏｕｎｄｂｙｓｔａｎｄａｒｄａｄｄｉｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｗｅｒｅｉｎｔｈｅｒａｎｇｅｏｆ５３．２％－１０４％，ｗｉｔｈｖａｌｕｅｓｏｆＲＳＤ′ｓ（狀＝６）ｉｎｔｈｅｒａｎｇｅｏｆ０．５％－６．３％．犓犲狔狑狅狉犱狊：ＬＣＭＳ／ＭＳ；Ｓｗｉｎｅｒｙｗａｓｔｅｗａｔｅｒ；Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ；Ｓｏｌｉｄｐｈａｓｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ收稿日期：２０１３０１１０基金项目：国家高技术研究发展计划（８６３）重大项目　（２０１２ＡＡ０６Ａ３０４）；嘉兴市科技计划项目（２０１２ＡＺ１０１３）作者简介：闾幸（１９８７－），女，江苏南通人，硕士研究生，主要　研究方向为集约养殖外源化学品污染监测与控制。联系人。Ｅｍａｉｌ：[e-mail]　　抗生素广泛用于预防和治疗动物疾病。我国是抗生素的生产和使用大国，据统计每年约有８０００ｔ抗生素被用作饲料添加剂［１］。这些抗生素被生物体本身利用较少，经动物体代谢后大部分以母体化合物或代谢体的形式经动物粪便和尿液排出体外。抗·３７２·闾幸等：固相萃取液相色谱串联质谱法测定猪栏废水中１０种抗生素生素种类繁多且性质差异较大，很多抗生素难以通过生物降解去除［２３］，因此养猪废水和废弃物即使经过处理也难以取得理想的无害化效果，大量抗生素进入环境介质，对生态环境产生不良影响［４５］。养猪废水中有机物浓度高，成分复杂，抗生素多以痕量存在，检测难度较大。有文献报道采用固相萃取液相色谱质谱法对北京和上海代表性的畜禽废水中四环素类、磺胺类和大环内酯类进行了污染特征调查［２］；采用固相萃取液相色谱串联质谱法对地表水和养猪废水中的四环素类、磺胺类、喹诺酮类和氯霉素进行同步分析［６］；采用固相萃取高效液相色谱串联质谱法测定了蜂蜜中的２６种抗生素及地表水中１９种抗生素［７８］。本工作在前人研究的基础上选取常用４类兽用抗生素为研究对象，建立了适合养猪废水的四环素类（四环素、土霉素、金霉素）、磺胺类（磺胺二甲嘧啶、磺胺甲唑）、喹诺酮类（恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星）、大环内酯类（泰乐菌素、罗红霉素）等４类抗生素的固相萃取液相色谱串联质谱测定方法，为生猪养殖业外源化学品的污染风险评估及有效防控提供数据支持。１　试验部分１．１　仪器与试剂Ｗａｔｅｒｓｅ２６９５型液相色谱仪，配ＷａｔｅｒｓＴＱＤｅｔｅｃｔｏｒ型串联三重四极杆质谱；Ｓｕｐｅｌｃｏ十二孔固相萃取装置；ＷａｔｅｒｓＯａｓｉｓＨＬＢ固相萃取柱（２００ｍｇ／６ｍＬ）；ＨＳＣ１２Ａ型氮吹仪；０．７μｍＧＦ／Ｆ玻璃纤维滤膜；０．２２μｍ聚四氟乙烯膜ＰＴＦＥ。抗生素混合标准储备溶液：１００ｍｇ·Ｌ－１，分别称取磺胺甲唑（ＳＭＸ）、磺胺二甲嘧啶（ＳＭＤ）、四环素（ＴＣ）、金霉素（ＣＴＣ）、土霉素（ＯＴＣ）、环丙沙星（ＣＩＰ）、诺氟沙星（ＮＯＲ）、恩诺沙星（ＥＮＲ）、泰乐菌素（ＴＹＬ）、罗红霉素（ＲＴＭ）等１０种抗生素标准品０．０１０ｇ，用甲醇定容至１００ｍＬ。使用时稀释至所需质量浓度，４℃下密封保存，现配现用。甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯，其他试剂为分析纯，试验用水为去离子水。１．２　仪器工作条件１）色谱条件　ＡｇｌｉｅｎｔｅｃｌｉｐｓｅＸＤＢＣ１８色谱柱（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ，５μｍ）；柱温３０℃；进样量１０μＬ；流量０．３ｍＬ·ｍｉｎ－１；流动相Ａ为０．１％（体积分数，下同）甲酸溶液，Ｂ为乙腈。梯度洗脱程序：０～２ｍｉｎ时，Ａ为９０％；２～８ｍｉｎ时，Ａ由９０％降至６０％；８～２４ｍｉｎ时，Ａ由６０％降至１０％；２４～２６ｍｉｎ时，Ａ由１０％升至９０％，再用４ｍｉｎ重新平衡色谱柱。２）质谱条件　电喷雾离子源，正离子模式，多反应监测（ＭＲＭ）模式，毛细管电压４ｋＶ；离子源温度１２０℃，载气温度３５０℃；载气流量５５０Ｌ·ｈ－１，锥孔气流量５０Ｌ·ｈ－１，其他质谱参数见表１。表１　质谱参数犜犪犫．１　犕犛狆犪狉犪犿犲狋犲狉狊化合物保留时间／ｍｉｎ定量离子定性离子质荷比犿／狕碰撞能量／Ｖ质荷比犿／狕碰撞能量／ＶＴＣ１３．３４４５．３，４１０．３２０４４５．３，４２７．４１０ＯＴＣ１２．９４６１．５，４２６．４２０４６１．５，４４３．５１５ＣＴＣ１４．５４７９．５，１５４．２３０４７９．５，４４４．２２０ＳＭＤ１４．７２７９．２，１８６．３１７２７９．２，１５６．３２０ＳＭＸ１６．７２５４．２，９２．２２５２５４．２，１５６．４２５ＥＮＲ１３．１３６１．０，３１７．３２０３６１．０，３４３．４２０ＣＩＰ１２．８３３２．２，２８８．２１７３３２．２，３１４．４２５ＮＯＲ１２．６３２０．３，２７６．４１８３２０．３，３０２．３２０ＴＹＬ１５．９９１６．８，１７４．１４０９１６．８，７２２．５３０ＲＴＭ１７．５８３８．２，１５８．１３０８３８．２，６７９．５２０１．３　试验方法养猪废水中抗生素经下述方法固相萃取浓缩２０倍。２０ｍＬ养猪废水用水稀释１０倍，移入２００ｍＬ棕色玻璃瓶中，加入０．２ｇＥＤＴＡ二钠盐，于４℃保存，３日内使用。·４７２·闾幸等：固相萃取液相色谱串联质谱法测定猪栏废水中１０种抗生素水样经０．７μｍ玻璃纤维滤膜过滤后，用６ｍｏｌ·Ｌ－１盐酸溶液调节ｐＨ至２．５～４．０之间，用ＨＬＢ小柱固相萃取（ＨＬＢ柱使用前经以下３步反复活化３次：①甲醇２ｍＬ；②水２ｍＬ；③ｐＨ３的盐酸溶液２ｍＬ）；然后过水样，流量为５ｍＬ·ｍｉｎ－１，对ＨＬＢ柱抽真空干燥３０ｍｉｎ；再使用甲醇（５＋９５）溶液２ｍＬ淋洗，最后用６ｍＬ甲醇缓慢洗脱，洗脱液收集至１０ｍＬ玻璃离心管中，氮气吹脱至近干，用甲醇定容至１ｍＬ，用０．２２μｍ有机滤膜过滤后转移至２ｍＬ棕色样品瓶中，按仪器工作条件进行测定。２　结果与讨论２．１　色谱行为按仪器工作条件对０．００５～０．１ｍｇ·Ｌ－１１０种抗生素标准溶液进行测定，色谱图见图１。图１　标准溶液的色谱图Ｆｉｇ．１　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｏｆｓｔａｎｄａｒｄｓｏｌｕｔｉｏｎ２．２　流动相的选择文献［７，９］报道乙腈与０．１％甲酸溶液作为二元流动相体系适合用于各种抗生素的检测，试验也选择这种流动相体系进行试验，结果表明：以乙腈与０．１％甲酸溶液进行梯度洗脱，分离效果好，且峰形窄，表明这种流动相体系对抗生素的分离效果较佳。２．３　固相萃取条件的选择ＯａｓｉｓＨＬＢ固相萃取小柱对亲水性或亲脂性的目标物都有较好的保留效果，适合同步萃取不同极性的目标物，试验采用ＯａｓｉｓＨＬＢ固相萃取小柱富集养猪废水中的１０种目标抗生素。２．３．１　酸度为考察酸度对固相萃取效率的影响，试验采用６ｍｏｌ·Ｌ－１盐酸溶液和１ｍｏｌ·Ｌ－１氢氧化钠溶液调节３份水分别呈酸性（ｐＨ在２．５～４．０之间）、中性（ｐＨ在６．５～７．５之间）和碱性（ｐＨ在８．５～１０．０之间），按试验方法计算各抗生素的加标回收率，酸性条件的加标回收率在６２．４％～１０６％之间，中性条件下的加标回收率在６．９％～５７．４％之间，碱性条件下的加标回收率在５．１％～４５．４％之间。因所有目标物在酸性条件下的回收率最高，试验选用６ｍｏｌ·Ｌ－１盐酸溶液调节ｐＨ在２．５～４．０之间。２．３．２　过柱水样体积按试验方法考察富集浓缩２０，５０，１００倍时对固相萃取效率的影响。结果表明：水样体积大于２０ｍＬ以上，样品通过小柱的速率非常缓慢甚至出现堵塞现象。由于猪场废水的基质浓度较高，一方面会与抗生素产生竞争吸附，导致目标物穿透萃取柱；另一方面废水中过多的物质保留在萃取柱中会造成堵塞。因此试验将２０ｍＬ水样稀释１０倍后上柱，从而有利于目标物与吸附剂充分接触，得到更高的吸附效果。２．３．３　洗脱溶剂洗脱溶剂的极性对洗脱效果与基线产生影响。试验考察了甲醇与甲醇二氯甲烷（１＋１）混合液两种洗脱溶剂对回收率的影响，以及不同洗脱溶剂对基线的干扰程度，结果表明：两种溶剂对去离子水的加标回收率分别在６２．０％～１０６％，５９．０％～１１０％之间，均有很好的洗脱效果，但使用甲醇洗脱时，质谱检测受到的干扰更少，且二氯甲烷相对较