WB-Western-Blot实验步骤及讲解

WesternBlot通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色，通过分析着色的位置、深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。概念一个基因表达终极结果是产生相应的蛋白质（或酶）。因此检测蛋白质是测定基因表达的主要标志。Native-PAGESDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分类SDS-PAGE中的蛋白需先变性展开再进行研究，主要是根据蛋白的质量在凝胶中进行分离，特别适用于评估蛋白质量的变化。原理器材：匀浆器、EP管（10ml、1.5ml、100ul）、弯镊、96孔板、冰盒酶标仪、低温离心机、电子秤等前期准备——蛋白提取试剂：蛋白裂解液、PMSF工作液/蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、BCA蛋白浓度测试盒、5×蛋白上样缓冲液蛋白提取步骤1.于-20℃冰箱取出蛋白裂解液及PMSF等，常温下溶解；BCA测试盒、5×Buffer置冰上备用；将已高压消毒的匀浆器及弯镊置冰上冷却备用；开启低温离心机调至4℃备用、烤箱调至37℃备用。2.组织样本于冰上冻融后，称取适量组织（约30-50mg）放入匀浆器中，准确记录所夹取组织重量。3.计算应加入裂解液和PMSF的体积：蛋白裂解液（ul）=组织重量（mg）×12、PMSF（ul）=组织重量（mg）×0.2。根据上述数值将液体分别加入匀浆器中。4.于匀浆器中碾磨，至无肉眼可见组织即可，用移液枪将碾磨后的液体转移至1.5mlEP管内，静置30min，每5min摇晃混匀以便裂解液和组织充分发生反应。为了防止蛋白降解、去磷酸化，各种蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂都是必须的。蛋白提取步骤5.上述裂解液于低温离心机内离心，12000rpm×15min，4℃。6.离心完成后，小心取出离心管，可见液体分成3层，上层为白色脂肪层，中层为澄清蛋白质溶液，下层为组织沉淀，用适当量程的移液枪小心吸取中间层蛋白溶液于1.5mlEP管中，记录所吸取体积（ul）。注意：宁可少吸不可多吸！脂肪层蛋白质溶液组织沉淀蛋白提取步骤7.打开96孔板，标记加样，进行蛋白浓度测定。7.根据BCA测试盒说明书，计算所需A液和B液的量。以每一个小孔里面加入200ul混合液计算，例如需要用到96孔板中的24个孔，则需配制混合液24×200=4800ul，其中A液：B液=50：1，考虑到加样过程中会有液体损失，适当增加配液总体积，可直接加入4800ulA液，4800/50=96ulB液，吹打混匀。8.向96孔板里面依次加入200ul的AB混合液，再依次加入各蛋白样本，完毕后敲打孔板侧身使混合液与蛋白样本充分混匀。9.96孔板置于37℃烤箱孵育30min。蛋白提取步骤y=0.8302x+0.1174R²=0.998800.10.20.30.40.50.600.10.20.30.40.50.6蛋白提取步骤蛋白提取步骤蛋白提取步骤10.蛋白变性。按照蛋白原液体积：5×上样缓冲液=4:1的比例，在对应样本中加入5×上样缓冲液后煮沸5min，室温冷却后置-80℃冰箱保存。蛋白煮沸变性一般是95~100°C，5~10min，水浴锅煮沸时，可用带夹EP管防止EP管盖弹开，使水浴锅内的水进入而使样品废掉。材料：蛋白样本（已变性）器械：玻璃板（厚板及薄板）、玻璃板架、梳子、枪头、移液枪、PVDF膜、滤纸、口罩、手套前期准备1配胶试剂盒碧云天/博士德25×上样Buffer碧云天3蛋白Marker赛默飞4TrisBase生工5甘氨酸生工6SDS粉末生工7脱脂奶粉博士德8BSA（牛血清白蛋白）Sigma9PBS或TBS粉末中杉金桥10Tween-2011化学发光液（ECL）12甲醇13一抗/二抗前期准备1.配制SDS凝胶（1）将玻璃板对应安装至玻璃架，配制相应浓度的分离胶（按照每块凝胶需5ml混合液的量计算）。（2）加入TEMED混匀后，立即灌入两块玻璃板之间的空隙，每块凝胶约需分离胶4ml。灌胶完成后立即用无水乙醇封边。（3）室温静置待胶凝固，倒掉上层封边液体，并用滤纸吸干上层空间。（4）配制浓缩胶，每块凝胶约需2ml，加入分离胶的上层空间后，立即插入相应尺寸的梳子。（5）室温静置。注意：清洗玻璃板！防止起泡产生！注意TEMED毒性，避免吸入和接触！实验步骤实验步骤2、SDS凝胶电泳（1）配制电泳液及电转液（电转液的甲醇在使用前添加，加入后置于4度冰箱待用）。（2）将玻璃板安装于电泳槽架子上以后，向内加入少许电转液观察是否有漏液，若无即可放入电泳槽中，若有漏液需重新夹取玻璃板。（3）轻轻拔出凝胶中的梳子，两侧用力均匀保证加样孔无歪斜。（4）将电泳槽内外均加入足量电泳液以后，开启电泳仪电源，将电压调为60V，预电泳15min，疏通凝胶分子孔径。（5）预电泳完成后进行蛋白加样。若有多余孔道需用1×Buffer封边，并设置一孔加入预染Marker。（6）电泳。电压调为80V使蛋白样品在浓缩胶内电泳，然后将电压调为110V使蛋白样品在分离胶内电泳，至所需目的蛋白充分分离后停止（根据Marker所标记位置估计切胶宽度≥1cm）。实验步骤实验步骤实验步骤结合SDS-PAGE原理，加样前蛋白样品会先加热→蛋白去折叠。电泳槽中含有缓冲液，使得电流通过凝胶传导。加入蛋白样品和Marker后进行电泳。放置电极时注意将负电极置于顶部而正电极置于底部。Marker中的标准蛋白（由多种已知分子量大蛋白组成）可对照形成蛋白阶带→测量凝胶电泳后蛋白的分子量。3、电转（1）电泳完成后，切胶，电转。电转时按照海绵（1层）、滤纸（2-3层）、凝胶、PVDF膜、滤纸（2-3层）、海绵（1层）的顺序依次铺平，膜和所切下来的凝胶大小对应。注意：避免膜和胶之间的气泡！（2）开启电转仪，设置电流为250mA，根据目的蛋白分子量大小确定电转时间,1kd大约转膜1min。实验步骤3、电转由于凝胶太脆难以进行抗体与蛋白的自由结合及检测、显影等操作，故需转膜。目前常用NC膜（硝化纤维膜）、PVDF膜（聚偏二氟乙烯膜）。通过电转移法即将电场加于凝胶——使蛋白移出并附着在薄膜上。除此之外，为了防止过热导致转膜板夹层中形成气泡，故转膜时应该置于冰槽中，且注意将冰块置于黑板所在处。实验步骤实验步骤根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的印迹膜。因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。通常用0.45μm和0.22μm两种规格的印迹膜。大于30KD的蛋白可用0.45μm的膜。小于30KD的蛋白就要用0.2μm的膜。3、电转4、封闭电转完成后，直接取出PVDF膜，可见预染Marker，放入5%新鲜配制牛奶/BSA封闭1-1.5h（5g牛奶/BSA+100mlPBST,注意保质期问题），封闭条件：37度，摇床，50r/min。实验步骤因为用于WB的膜对蛋白包括抗体具有高度亲和力，故加抗体前可通过封闭→减少非特异性抗体与膜结合，封闭剂内的蛋白可覆盖膜上尚未结合蛋白的区域。➊脱脂奶是最常用的经济配方。❷脱脂奶粉不能与生物素化的抗体一起使用，因为脱脂奶粉含有糖蛋白和生物素；建议使用BSA。❸分析磷酸化蛋白须用BSA。脱脂奶粉含磷酸酶，用磷酸化特异性抗体分析磷酸化蛋白受到影响，因为磷酸酶与膜上的磷酸化蛋白接触可使之去磷酸化；也不适用于碱性磷酸酶（AP）检测系统。5、一抗孵育根据目的蛋白选择对应的一抗及合适的稀释比例，用封闭液对抗体进行稀释。一抗孵育条件：4℃冰箱，过夜（＞12h）。实验步骤建议孵育抗体之前一定要仔细看抗体说明书，了解抗体的种属来源和抗体的建议稀释比例。6、洗涤一抗。PBST，摇床（80-90r/min），3次×15min或4次×10min。7、二抗孵育选用针对一抗来源的二抗，配制成工作浓度后，均匀滴加于PVDF膜上。二抗孵育条件：37度，摇床（40r/min），1h。实验步骤二抗是能与荧光酶等结合并能识别一抗→使目标蛋白易于检测，并具有放大效应（一个二抗可以结合多个一抗），最后通过其能与辣根过氧化物酶聚合并产生光（HRP法）或其他方法等进行曝光检测。选择二抗抗体取决于一抗抗体的种属来源。例如，如果一抗抗体是小鼠来源单克隆抗体，二抗抗体必须是抗小鼠的抗体；如果一抗抗体是兔来源多克隆抗体，二抗抗体必须是抗兔的抗体。8、洗涤二抗。PBST，摇床（80-90r/min），3次×15min或4次×10min。9、化学发光法显色准备一个蜡板用于铺膜；按照1:1的比例配制化学发光液，均匀滴加于蜡板上铺好的的PVDF膜上后，操作电脑进行曝光。10、曝光完毕后，整理实验器材，及时拷取实验数据进行分析。实验步骤实验步骤免疫印迹（Westernblot,WB）是分子生物学中检测复杂生物提取物中特定蛋白质存在的最常用方法之一。WB必须控制上样量以确保目标蛋白变化具有可比性，通常选择在所有组织中普遍分布的具有相对恒定量的蛋白质作为内参（Loadingcontrol）。内参当然WB实验中的内参选择也是至关重要，毕竟它以表达水平不变的蛋白作为对照，能确保不同操作孔中所加样品量相接近，减少误差。选择的依据主要是分子量大小、表达水平、表达因素等，常用的如β-Actin、GAPDH等。内参β-Actin广泛分布于胞浆，表达量丰富。内参Thanksforwatching！