HPLC高效液相色谱

Tanghui.pha.shzu1高效液相色谱法HighPerformanceLiquidChromatography，HPLCTanghui.pha.shzu2高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。为了更好地了解高效液相色谱法优越性，现从两方面进行比较：第一节概述Tanghui.pha.shzu31．高效液相色谱法与经典液相色谱法HPLC优点：高速、高效、高灵敏度、高自动化。高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。由于经典色谱是重力加料，流出速度极慢；而高效液相色谱配备了高压输液设备，流速最高可达10cm3·min-1.如分离苯的羟基化合物，7个组分只需1min就可完成。对氨基酸分离，用经典色谱法，柱长约170cm，柱径0.9cm，流动相速度为30cm3·h-1，需用20多小时才能分离出20种氨基酸；而用HPLC，只需lh之内即可完成。又如用25cm×0.46cm的Lichrosorb－ODS(5μ)的柱，采用梯度洗脱，可在不到0.5h内分离出尿中104个组分.第一节概述Tanghui.pha.shzu42．HPLC与GC(1)GC分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的20％。对于占有机物总数近80％的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要采用HPLC进行分离和分析。(2)GC采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即不产生相互作用力，仅起运载作用。而HPLC中流动相可选用不同极性的液体，选择余地大，它对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争。因此，流动相对分离起很大作用，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了极大方便。第一节概述Tanghui.pha.shzu5(3)GC一般都在较高温度下进行的，而HPLC法则经常可在室温条件下工作。总之，HPLC是吸取了GC与经典液相色谱优点，并用现代化手段加以改进，因此得到迅猛的发展。目前HPLC已被广泛应用于分析对生物学和医药上有重大意义的大分子物质，例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质的分离和分析。HPLC主要缺点：仪器设备费用昂贵，操作严格。第一节概述Tanghui.pha.shzu63.液相色谱分离原理及分类和GC一样，LC分离系统也由固定相和流动相组成。其固定相可以是吸附剂、化学键合固定相（或在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换树脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂。被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进行分离。色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作用，作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。根据分离机制不同，液相色谱可分为：液固吸附色谱、液液分配色谱、化合键合色谱、离子交换色谱以及分子排阻色谱等类型。第一节概述Tanghui.pha.shzu7第二节高效液相色谱仪器Tanghui.pha.shzu8第二节高效液相色谱仪器一、流程（processofHPLC）首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。Tanghui.pha.shzu9第二节高效液相色谱仪器Tanghui.pha.shzu10二、主要部件（mainassemblyofHPLC）第二节高效液相色谱仪器4（6）个主要部分：高压输液系统；脱气装置；梯度洗脱；进样系统；分离系统；检测系统；此外还配有自动进样及数据处理等辅助装置。Tanghui.pha.shzu11第二节高效液相色谱仪器Tanghui.pha.shzu121．高压输液系统由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成。高压输液泵核心部件。压力：150～350×105Pa。应符合密封性好，输出流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求。第二节高效液相色谱仪器Tanghui.pha.shzu13第二节高效液相色谱仪器常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。恒流泵特点：在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化无关；恒压泵特点：能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重视性差。它们各有优缺点。目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流泵又称机械泵，它又分机械注射泵和机械往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。Tanghui.pha.shzu14第二节高效液相色谱仪器输液泵按工作方式分为气动泵和机械泵两大类。机械泵中又有螺旋传动注射泵、单活塞往复泵、双活塞往复泵和往复式隔膜泵。几种输液泵的基本性能见下表。名称恒流或恒压脉冲更换流动相梯度洗脱再循环价格气动放大泵恒压无不方便需两台泵不可高螺旋传动注射泵恒流无不方便需两台泵不可中等单活塞往复泵恒流有方便可可较低双活塞往复泵恒流小方便可可高隔膜往复泵恒流有方便可可中等Tanghui.pha.shzu15第二节高效液相色谱仪器（动画）Tanghui.pha.shzu16第二节高效液相色谱仪器双活塞往复泵：如下图a所示，双活塞往复泵有一个精心设计的偏心凸轮，用同步电机或变速直流电机驱动偏心凸轮，偏心凸轮再推动两活塞作往复运动。偏心凸轮短半径端所对应的活塞向外伸，使该活塞的下单向阀打开吸入流动相，与此同时，偏心凸轮的长半径端所对应的另一活塞被推入，使其上单向阀打开，并将流动相送至色谱柱。于是，两活塞交替伸缩，往复运动，获得的排液特性如图b所示，即具有稳定的输出流量，这样就能避免单活塞泵液流脉冲的问题。Tanghui.pha.shzu17第二节高效液相色谱仪器双活塞往复泵的输液流量比单活塞泵小得多。优点：不必使用消除脉冲的阻尼器，避免了阻尼器的压力消耗。缺点：设备成本较高，流量调节也比单活塞泵复杂。双活塞往复泵的构造和排液特性Tanghui.pha.shzu18（动画）第二节高效液相色谱仪器优点：隔膜泵活塞不直接与流动相接触，故不存在活塞密封垫磨损对流动相的污染。隔膜泵死体积小（约0.1mL），因此，更换流动相后平衡快，利于梯度洗脱。缺点：结构较复杂，价格较贵，和单活塞机械往复泵一样，也产生脉冲，也需要配置阻尼装置来消除脉冲。Tanghui.pha.shzu19第二节高效液相色谱仪器2.脱气装置流动相溶液往往因溶解有氧气或混入了空气而形成气泡。气泡进入检测器后会在色谱图上出现尖锐的噪音峰。小气泡慢慢聚集后会变成大气泡，大气泡进入流路或色谱柱中会使流动相的流速变慢或出现流速不稳定，致使基线起伏。气泡一旦进入色谱柱,排出这些气泡则很费时间。在荧光检测中,溶解氧还会使荧光淬灭。溶解气体还可能引起某些样品的氧化或使溶液pH值发生变化。Tanghui.pha.shzu20第二节高效液相色谱仪器目前，液相色谱流动相脱气使用较多的是：①离线超声波振荡脱气；②在线惰性气体（氦气）鼓泡吹扫脱气；③在线真空脱气。真空脱气装置：将流动相通过一段由多孔性合成树脂膜制造的输液管，该输液管外有真空容器，真空泵工作时，膜外侧被减压，分子量小的氧气、氮气、单流路真空脱气装置的原理二氧化碳就会从膜内进入膜外而被脱除。一般真空脱气装置有多条流路，可同时对多个溶液进行脱气。Tanghui.pha.shzu21第二节高效液相色谱仪器Tanghui.pha.shzu22第二节高效液相色谱仪器3.梯度洗脱装置在进行多成分的复杂样品的分离时，经常会碰到前面的一些成分分离不完全，而后面的一些成分分离度太大，且出峰很晚和峰型较差。为了使保留值相差很大的多种成分在合理的时间内全部洗脱并达到相互分离，往往要用到梯度洗脱技术。HPLC的梯度洗脱是指流动相梯度，即在分离过程中改变流动相的组成或浓度。①线性梯度;②阶梯梯度高压梯度低压梯度Tanghui.pha.shzu23第二节高效液相色谱仪器高压梯度装置结构优点：只要通过梯度程序控制器控制每台泵的输出，就能获得任意形式的梯度曲线，而且精度很高，易于实现自动化控制。缺点：使用了两台高压输液泵，使仪器价格变得更昂贵，故障率也相对较高，而且只能实现二元梯度操作。Tanghui.pha.shzu24第二节高效液相色谱仪器四元低压梯度系统结构只需一个高压泵，混合就在泵前安装了一个比例阀中完成。因比例阀是在泵之前，所以是在常压（低压）下混合，在常压下混合易形成气泡，常配置在线脱气装置，来自于四种溶液瓶的四根输液管分别与真空脱气装置的四条流路相接，经脱气后进入比例阀，混合后从一根输出管进入泵体。Tanghui.pha.shzu25第二节高效液相色谱仪器梯度淋洗装置外梯度:利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。内梯度:一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。Tanghui.pha.shzu264．进样系统HPLC柱比GC柱短得多（约5～30cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。柱外展宽可分柱前和柱后展宽。进样系统是引起柱前展宽的主要因素，因此HPLC法中对进样技术要求较严。流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置。结构如图所示：第二节高效液相色谱仪器Tanghui.pha.shzu27第二节高效液相色谱仪器（动画）Tanghui.pha.shzu285.分离系统——色谱柱色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。一般色谱柱长5～30cm，内径为4～5mm，凝胶色谱柱内径3～12mm，制备柱内径较大，可达25mm以上。一般在分离前备有一个前置柱，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离柱的性能不受影响。第二节高效液相色谱仪器Tanghui.pha.shzu29第二节高效液相色谱仪器柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填料（＜20μm）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。一般柱体为直型不锈钢管，内径1～6mm，柱长5～40cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。Tanghui.pha.shzu306．检测系统在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等。另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。第二节高效液相色谱仪器Tanghui.pha.shzu31（l）紫外检测器应用最广，对大部分有机化合物有响应。其特点：灵敏度高；线形范围高；流通池可做的很小（1mm×10mm，容积8μL）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。第二节高效液相色谱仪器Tanghui.pha.shzu32第二节高效液相色谱仪器UV/VisdetecterTanghui.pha.shzu33第二节高效液相色谱仪器(2)光电二极管阵列检测器紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波