可见光分光光度法

第10章可见光分光光度法10.1基本原理10.2可见光分光光度法10.3可见光分光光度法的应用概述吸光光度法是以物质对光的选择性吸收为基础的分析方法。所用的仪器为分光光度计（又称为分光光度法）。根据物质所吸收光的波长范围不同，吸光光度法又有紫外、可见及红外分光光度分析法。本章重点讨论可见分光光度法。10.1可见光分光光度法的基本原理10.1.1物质对光的选择性吸收与物质的颜色10.1.2光吸收的基本定律10.1.3偏离朗伯-比尔定律的原因*10.1.1物质对光的选择性吸收与物质的颜色人眼能感觉的波长在400～750nm，为可见光区。光波是一种电磁波。电磁波包括无线电波、微波、红外光、可见光、紫外光、X射线、γ射线等。可见光只是电磁波中一个很小的波段。不同波长的可见光使人们感觉为不同的颜色。具有单一波长的光称为单色光。白光（日光）：是由各种单色光组成的复合光，当日光通过三棱镜时被分解为七色光（光的色散）：在可见光中有色光的互补关系若两种颜色的光按适当的强度比例混合后组成白光，则这两种有色光称为互补色。如图所示，成直线关系的两种光可混合组成白光。物质之所以呈现不同的颜色，是与它对互补色光的选择性吸收有关。（1）物质对光的选择性吸收当光束照射到某物质或溶液时，某些波长的光被溶液吸收。另一些波长的光不被吸收，产生反射、散射或透过溶液。溶液的颜色由透过光的波长所决定。溶液对光的作用若被照射的是均匀溶液，则光的散射可以忽略。例如：KMnO4溶液强烈地吸收黄绿色的光，对其他颜色的光吸收很少或不吸收，所以溶液呈现紫红色。（黄绿色与紫红色互补）又如：CuSO4溶液强烈地吸收黄色的光，所以溶液呈现蓝色。若溶液对白光中各种颜色的光都不吸收，则溶液为透明无色;反之则呈黑色。光的互补：蓝黄对于固体物质:当日光（复合光）照射到物质上时，如果物质对各种波长的光完全吸收则呈现黑色；如果完全反射则呈现白色；如果对各种波长的光均匀吸收则呈现灰色。各种物质的颜色（透过光）与吸收光颜色的互补关系列于下表中：物质颜色（互补色）吸收光颜色波长（nm）物质颜色与吸收光颜色和波长的关系黄绿紫400～450黄蓝450～480橙绿蓝480～490红蓝绿490～500紫红绿500～560紫黄绿560～580蓝黄580～600绿蓝橙600～650蓝绿红650～750（2）吸收曲线E=E2-E1=h：量子化、选择性吸收；用不同波长的单色光照射，测其吸光度A;以波长为横坐标,A为纵坐标作出吸收曲线；找到最大吸收波长max。M+热M+荧光或磷光M+hM*基态激发态E1（△E）E2phen-Fe(Ⅱ)吸收曲线吸收曲线的特点：①同一种物质对不同波长光的吸光度不同。吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长λmax②不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似λmax不变（图中：c1＜c2＜c3＜c4）。③不同物质，它们的吸收曲线形状和λmax则都不同。c1c2c4c3a.不同浓度的同一种物质，在某一定波长下吸光度A有差异，在λmax=508nm处吸光度A的差异最大。此特性可作为物质定量分析的重要依据。④吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的依据b.在λmax处吸光度随浓度变化的幅度最大，所以测定最灵敏。图10-3phen-Fe(Ⅱ)吸收曲线10.1.2光的吸收定律（1）朗伯—比耳定律•布格(Bouguer)和朗伯(Lambert)先后于1729年和1760年阐明了光的吸收程度和吸收层厚度的关系。A∝b•1852年比耳(Beer)又提出了光的吸收程度和吸收物浓度之间也具有类似的关系。A∝c•I0:入射光强度；It:透过光强度二者的结合称为：•朗伯—比耳定律，其数学表达式为：•A＝lg（I0/It)=εbc式中A：吸光度,描述溶液对光的吸收程度；b：液层厚度(光程长度)，通常以cm为单位；c：溶液的摩尔浓度，单位mol·L－１；ε：摩尔吸光系数，单位L·mol－１·cm－１；或:A＝lg（I0/It)=abcc：溶液的浓度，单位g·L－１a：吸光系数，单位L·g－１·cm－１•a与ε的关系为：a=ε/M（M为摩尔质量）透光度(透光率)T描述入射光透过溶液的程度T=It／I0吸光度A与透光度T的关系:A＝εbc＝－lgT朗伯—比耳定律是吸光光度法的理论基础和定量测定的依据。广泛地应用于紫外光、可见光、红外光区的吸收测量。（2）摩尔吸光系数ε的特性吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数，不随浓度c和光程长度b的改变而改变。在温度和波长等条件一定时，ε仅与吸收物质本身的性质有关。可作为定性鉴定的参数。同一吸收物质在不同波长下的ε值是不同的。在最大吸收波长λmax处的摩尔吸光系数，常以εmax表示。εmax表明了该吸收物质最大限度的吸光能力，也反映了光度法测定该物质可能达到的最大灵敏度。εmax越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测定该物质的灵敏度越高。ε105：超高灵敏；ε=(6～10）×104：高灵敏；ε2×104：不灵敏。ε在数值上等于浓度为1mol/L、液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度A(通常根据低浓度时的A间接求得ε)。吸光系数a(L·g-1·cm-1）相当于浓度为1g/L，液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度。A＝εbc或ε＝A/bc浓度为25.5μg/50ml的Cu2+溶液，用双环己酮草酰二腙光度法测定，在波长600nm处用2cm比色皿测量A=0.297，计算摩尔吸光系数。55.6350/105.253=1.9×104（L·mol-1·cm-1）解：已知Cu原子量为63.55，[Cu2+]==8.0×10-6（mol·L-1）cbA2100.8297.06ε==例：例题一有色化合物的0.0010%水溶液在2cm比色皿中测得透射比为52.2%。已知它在520nm处的摩尔吸光系数为2.24×103L/(mol·cm)。求此化合物的摩尔质量。解：A=-lgT=bc=b×(0.0010×1000/100)/Mr=b×0.010/MrMr=b×0.010/(-lgT)=2.24×103×0.010×2/(-lg0.522)=159(g/mol)10.1.3偏离朗伯—比耳定律的原因*标准曲线法测定未知溶液的浓度时，发现：标准曲线常发生弯曲（尤其当溶液浓度较高时），这种现象称为对朗伯—比耳定律的偏离。引起这种偏离的因素（两大类）：一类是物理性因素：由仪器的精度不够引起的。另一类是化学性因素：溶液发生相互作用引起的。图10-4标准曲线对比耳定律的偏离朗伯—比耳定律的前提条件之一是入射光为单色光。分光光度计只能获得近乎单色的狭窄光带。难以获得真正的纯单色光。复合光可导致对比耳定律的正或负偏离。非单色光、杂散光、非平行入射光都会引起对朗伯—比耳定律的偏离。但主要还是非单色光作为入射光引起的偏离。（1）物理性因素——非单色光引起的偏离非单色光作为入射光引起的偏离图10-5复合光对比耳定律的影响在图上A-c曲线上部(高浓度区)则弯曲愈严重。故朗伯—比耳定律只适用于稀溶液。防止非单色光引起偏离的措施：首先应选择比较好的单色器。此外还应将入射波长选定在待测物质的最大吸收波长且吸收曲线较平坦处。（2）化学性因素•朗伯—比耳定律的假定：所有的吸光质点之间不发生相互作用；假定只有在稀溶液(c10-2mol/L)时才基本符合。当溶液浓度c10－2mol/L时，吸光质点间可能发生缔合等相互作用，直接影响了对光的吸收。•故：朗伯—比耳定律只适用于稀溶液。•当溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配合物的形成等化学平衡时，也会使吸光质点的浓度发生变化，影响吸光度。例：铬酸盐或重铬酸盐溶液中存在下列平衡：CrO42-＋2H＋=Cr2O72-＋H2O（黄色）（橙色）碱性溶液中测CrO42-或酸性溶液中测Cr2O72-均可获得较满意的结果。若改变溶液的酸度会导致平衡移动，发生偏离比耳定律。10.2可见分光光度法10.2.1分光光度计的基本部件10.2.2显色反应及影响因素*10.2.3吸光度测量条件的选择10.2.1分光光度计的基本部件（1）光源光源单色器吸收池检测显示系统在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。可见光区：钨灯作为光源，其辐射波长范围在320～2500nm。（2）单色器①入射狭缝：光源的光由此进入单色器；②准光装置：透镜或反射镜使入射光成为平行光束；③色散元件：棱镜或光栅；可将复合光分解成单色光；④聚焦装置：透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝；⑤出射狭缝：单色光由此射入样品室→吸收池→检测显示系统。将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任波长单色光的光学系统。①②③⑤④吸收池④光源（3）吸收池样品室：吸收池（比色皿）和相应的池架附件。吸收池：石英池（紫外区）和玻璃池（可见区）。（4）检测系统①硒光电池②光电管③指示器利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号。用（硒）光电池（72）、光电管或光电倍增管（721、751）、（5）结果显示记录系统是把放大的信号以A或T的方式显示或记录下来的装置。有：检流计、微安表、数字显示记录仪、微机等进行仪器自动控制和结果处理。图10-7吸光度与透光率标尺刻度1.72型1.稳压电源开关2.波长调节器3.光路闸门4.单色器光源开关5.比色皿定位装置6.光亮调节器7.检流计电源开关8.零点调节器9.灵敏度调节器10.比色皿架72型光度计的安装示意图1.指示灯2.电源开关3.灵敏度选择按钮4.比色皿座定位拉杆5.透光率100电位器旋钮6.透光率0电位器旋钮7.波长调节旋钮8.波长示窗9.光密度（透光率）表10.比色皿暗箱盖721型分光光度计2.721型3.751型附：几种常用的分光光度计分光光度计国产型号工作范围λ/nm光源单色器接收器应用可见分光光度计72型721型420～700360～700钨灯钨灯玻璃棱镜玻璃棱镜硒光电池光电管无机物和有机物含量测定紫外-可见和近红外分光光度计751型或WFD-8型200～1000氢灯及钨灯石英棱镜或光栅光电管或光电倍增管无机物和有机物含量测定;有机物结构分析红外分光光度计WFD-3型760～40000硅碳棒岩盐真空热电偶有机物结构分析10.2.2显色反应及其影响因素*（1）显色反应及其选择（2）显色剂（3）显色反应条件的选择（1）显色反应及其选择显色反应：将待测物转变成有色化合物的反应。例如：钢中微量锰的测定，Mn2＋不能直接进行光度测定2Mn2＋＋5S2O82-＋8H2O=2MnO4-+10SO42-＋16H+生成紫红色的MnO4-在525nm处可以进行光度测定。配位显色反应:当金属离子与有机显色剂形成配合物时，通常会发生电荷转移跃迁，产生很强的紫外—可见吸收光谱。氧化还原显色反应:氧化剂：过二硫酸根OSOOSOOOOO2-ε大的显色剂显色反应灵敏度高显色剂显色条件λ最大（nm）ε氨铜试剂（DDTC）双环己铜草酰双腙（BCO）双硫腙pH5.7～9.2CCl4萃取pH8.9～9.60.1mol/L酸度CCl4萃取6204365955331.2×1021.3×1041.6×1045.0×104Cu2+的显色剂及其配合物的ε值选择显色反应时应考虑的因素：（1.1）灵敏度高：ε=104～105（1.2）选择性高：选择干扰小或易除去干扰的显色剂（1.3）显色剂在测定波长处无明显吸收RmaxMRmax两种有色物最大吸收波长之差：Δλ=称为“对比度”;要求60nm。（1.4）生成的有色化合物组成恒定化学性质稳定可以保证至少在测定过程中吸光度基本保持不变，否则将影响吸光度测定的准确性及重现性。(2)显色剂(2.1)无机显色剂：硫氰酸盐(测Fe,Mo,W)、钼酸铵(测P,Si,W)、过氧化氢(测Ti,V)等几种。(2.2)有机显色剂：种类繁多(偶氮类、三苯甲烷类等)有机显色剂中含有生色团和助色团。生色团(含不饱和键的基团,能吸收波长大于200nm的光)如：偶氮基（-N=N-），羰基（＞C=O）