RNA提取-RT-PCR实验报告

RNA制备及其鉴定实验目的初步掌握组织总RNA制备的原理及其基本方法，掌握RNA纯度鉴定的基本方法。实验原理细胞内的RNA通常与蛋白质结合，以核蛋白（RNP）的形式存在。分离制备RNA时，首先必须破碎细胞，使RNP释放到溶液中并与蛋白质分离，然后将RNA同其他的细胞成分分离开并保证RNA的完整性。本次实验我们选用了Trizol法分离提取小鼠肝组织的总RNA，Trizol法分离提取的RNA产率高、纯度好且不易降解。评价RNA质量的标准是RNA的均一性和完整性。均一的RNA取决于有效的去除RNA提取物中的DNA、蛋白质和其他杂质；完整的RNA取决于最大限度地避免纯化过程中内源性及外源性RNA酶对RNA的降解。通常采用紫外分光光度法测定RNA的浓度和纯度，纯RNA的A260/A280=2.0，但由于所用的标本不同，此比值有一定的变化，一般在1.8~2.0之间，低于改值表明有蛋白污染，需进一步用酚/氯仿抽提。RNA的完整性可通过琼脂糖电泳法进行鉴定。完整的RNA电泳时，28S和18SrRNA经EB染色后，两条电泳条带的显色强度近似为2比1。本实验中几个重要试剂的作用：Trizol试剂：Trizol的主要成分是苯酚、异硫氰酸胍、十二烷基肌氨酸钠、β-巯基乙醇、醋酸钠、柠檬酸钠。它的主要作用是1、裂解细胞，使细胞中的蛋白、核酸物质解聚得到释放。2、使蛋白质变性，有利于DNA和RNA与蛋白质的分离。3、抑制内源和外源RNase。氯仿：氯仿的作用有多个方面，一、作为有机溶剂变性蛋白，使其沉淀并通过离心除去。二、通过变性作用抑制RNase活性；三、通过氯仿把水相里参与的苯酚抽提掉；四、作为溶剂抽提样品中的一些脂溶性杂质（比如油脂、脂溶性色素等），起到一定除杂作用。异丙醇：异丙醇是沉淀核酸用的，作用和乙醇一样。只不过用量要比乙醇少。异丙醇是等体积，而乙醇一般需要2.5倍体积。在水相很多，离心管容积有限，加不下太多乙醇的时候一般会用异丙醇沉淀。75%乙醇：应用无水乙醇+DEPC水制备。用乙醇洗涤沉淀，可去除所有残留的蛋白质和无机盐.RNA样品中如果含有无机盐,有可能对后续实验操作中的一些酶促反应产生抑制作用。实验步骤按规定的操作步骤进行操作，特别注意创造一个无RNA酶的环境。实验结果经RNA琼脂糖电泳后，紫外灯下观察RNA分离情况如下图：可观察到未见明显28S和18S条带，可见少量5S条带，实验结果并不满意。采用紫外分光光度法测定出RNA的浓度和纯度，结果如下：RNA的A260/A280=1.057/0.920=1.15，说明有蛋白污染，RNA纯度不高。实验讨论实验结果中未见28S和18S条带，5S条带显色强度不强，说明RNA已被大量降解或者起初提取的RNA总量并不是很大。有多种原因可能会导致这种结果，回顾操作过程中的细节并总结分析，可以得到如下结论：1、RNA酶是一种耐热、耐酸、耐碱、不需要辅助因子且能迅速降解RNA的一种酶，蛋白质变性剂只能使之暂时失活，变性剂去除后，其活性又可恢复，而且这种酶广泛存在于人的皮肤、周围的环境中。在操作本实验时，实验室人多且经常活动，使用枪头的时候用完之后没有及时盖上，对着EP管呼吸等难免会有或多或少的RNA酶污染试剂或试管污染，从而导致实验失败。2、在匀浆时加入了2mlTrizol试剂，导致匀浆体积太大，匀浆后，为保证后续操作步骤能与其他组同步，我们选择倒掉了一部分匀浆液，因而造成本组RNA总量减少，从而导致实验失败。3、RNA的A260/A280=1.057/0.920=1.15，一是说明可能有蛋白DNA残留，二是说明可能有酚残留，原因可能是抽提的时候操作不当。可用氯仿重新抽提，沉淀，溶解。另外也有可能是分光光度计设备的问题。综上所述，在进行RNA制备及鉴定实验的时候一定要特别注意创造一个无RNA酶的环境，每一个操作步骤都应该胆大心细，尽量避免不规范的操作。反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术实验目的：通过本实验，掌握RT-PCR的基本原理和基本操作技能。实验原理：PCR是一种在体外大量扩增特异基因片段的分子生物学技术。其利用合成的两段已知序列的寡核苷酸作为引物，将位于两引物之间的特定基因片段进行复制，经过多次循环，使模板上特定基因拷贝数呈指数级增长，具有省时、操作简便、特异性强、灵敏度高、效率高、应用范围广等特点。PCR反应过程分为三步：变性、退火、延伸。RT-PCR其基本原理是将mRNA反转录合成cDNA后再经PCR进行大量扩增，实质上是对mRNA的扩增，我们常利用此技术克隆cDNA或分析某一特异基因在组织细胞中的表达情况。利用此技术进行特定基因片段的克隆时，要特别注意引物的设计。实验步骤按规定的操作步骤进行操作。实验结果经PCR产物琼脂糖电泳后，紫外灯下观察PCR产物分离情况如下图：可观察到，与对照组相比，未见明显的PCR产物条带出现，实验结果并不满意。实验讨论与对照组相比，未见明显的PCR产物条带出现，可能的原因有很多，可主要分为以下几点：1、在RNA制备及鉴定实验中，我们可以观察到的结果是RNA被大量降解，这样可能导致在进一步反转录成cDNA和PCR时，几乎没有模板，从而导致实验失败。2、PCR反应体系应该是最有可能导致实验失败的地方，但是从对照组来看，对照组条带显色很强，所以基本上可以排除PCR反应体系出现问题的情况。3、电泳时，在向加样孔中加样时，可能会因没有混匀或操作不当而导致样品丢失，我们在操作这一步骤时，虽然有大部分样品都沉淀在加样孔中，但是仍有部分样品漂浮起来，这也可能是导致失败的一个原因。另外，加试剂顺序可能也会影响电泳的结果。综上所述，在做RT-PCR时，首先要对提取的总RNA的量进行鉴定，最好是电泳，以确定RNA的纯度和浓度。然后再进行反转录、PCR以获取自己想要的基因片段。在PCR时，PCR反应体系也是一个十分重要的部分，要保证反应体系无误。例外，实验技能的操作规范程度、熟练程度也是影响实验结果的一个重要因素。