实时荧光定量PCR反应

荧光定量PCR技术生化教研室研究生实验一、实验目的•掌握荧光定量PCR的原理•熟悉荧光定量PCR的操作步骤•了解荧光定量PCR的应用二、实验原理•ABIPrism®7500型荧光定量PCR仪•7500功能一览：••绝对定量(AbsoluteQuantification)•–自动计算基线、阈值、CT值、浓度、百分比••相对定量(RelativeQuantification)••等位基因分型(AllelicDiscrimination)••阴阳性鉴定(Plus/MinuswithIPC)实时荧光定量PCR技术原理•聚合酶链式反应（PCR）可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增，扩增反应结束后，可通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性分析，也可以通过放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量分析。无论定性还是定量分析，分析的都是PCR终产物。实时荧光定量PCR•通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR反应中，引入一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。实时荧光定量PCR技术：荧光阈值和CT值•荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3~15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。•每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT值（thresholdvalue）三、实验内容：定量细菌16SRNA基因•引物F：TCCTACGGGAGGCAGCAGT•引物R:GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT扩增片段447bp•Stage195℃30s1cycle•Stage295℃5s60℃45s40cycle•Stage395℃15s60℃1min95℃15s实验分组•按实验台分六组。•第一组：做阴性对照和样品，各做2个重复。•第二组：标准曲线一个浓度（10-1），做2个重复。•第三组：标准曲线一个浓度（10-2），做2个重复。•第四组：标准曲线一个浓度（10-3），做2个重复。•第五组：标准曲线一个浓度（10-4），做2个重复。•第六组：标准曲线一个浓度（10-5），做2个重复。操作步骤：（见下发的资料页）四、五、实时荧光定量PCR技术的应用六、思考题•1.荧光定量PCR的原理和应用实例。•2.使用SYBRGreenI作荧光染料，如何提高荧光定量PCR结果可靠性？七、实验报告•每人写一份实验报告，交至：10号楼10楼1012室•包括：目的、原理、操作注意事项、结果、讨论