细胞培养培养物的观察和检测方法

课程安排及进度体外培养的原理与技术薛庆善主编广西医科大学组胚教研室何少健电话：[phone](办)体外培养的基本原理与技术一、从体内生存环境到体外生长条件二、体外培养的基本方法和过程三、体外培养物的生长生物学四、细胞分离与纯化五、细胞系（株）、细胞克隆六、培养物的观察检测方法无论是在进行体外培养的过程中还是在培养工作结束之后，经常需要对培养物（培养的细胞或者植块）进行观察检测，以了解培养物的生长状况，研究培养物的生命活动变化。这方面的内容涉及到形态学、细胞生物学、生理生化、遗传学以及分子生物学等多学科的技术手段。观察检测体外培养物最常用的技术方法，包括：培养物的观察检测方法1.活细胞的观察检测方法2.普通染色观察3.细胞化学技术4.免疫细胞化学技术5.原位杂交技术6.电子显微镜技术培养物的观察检测方法1.1相差显微镜观察培养物的形态结构由于培养的细胞在生活状态下，几乎是透明的，结构之间的反差很小，如果用普通光学显微镜观察，看不清活细胞的形态结构。若要观察其微细结构和变化，就须借助能够增强结构之间反差的特殊显微镜，此即相差显微镜（phasecontrastmicroscope)。相差显微镜专门用于对体外培养的活细胞进行观察。用相差显微镜可直接观察到活细胞的形态结构、分裂增殖的动态变化及细胞运动等各种生命现象。1.活细胞的观察检测方法相差显微镜的原理：用一般光镜之所以难以看清活细胞，是由于活细胞无色透明，当光波通过它时，颜色和亮度变化不大。相差显微镜则是利用细胞内各结构密度的不同而对光产生折射率有差异的原理，在折射率大的物体中比折射率小的物体中光波前进的距离较短，此距离差异叫光程差，由于光程差引起光的相位变化称为相位差或相差。使用相差显微镜可使用肉眼不能分辨的相位差变为可分辨的振幅差（即明暗差），故使无色透明的物体在镜下其结构的反差显著，影像清晰。培养物的观察检测方法1.1.1相差显微镜1.活细胞的观察检测方法1.1相差显微镜观察培养物的形态结构PaleSquamousCells(scrapingsfromtheinsideofmouth)1600x–BrightFieldPaleSquamousCells(scrapingsfromtheinsideofmouth)1600x-PhaseContrast培养物的观察检测方法1.1.2用相差显微镜观察活细胞的方法（略）1.活细胞的观察检测方法1.1.1相差显微镜1.1相差显微镜观察培养物的形态结构1.1.3活细胞的动态观察与缩时电影（略）培养物的观察检测方法1.活细胞的观察检测方法1.2细胞计数法细胞计数法（cellcounting）是用来计数细胞悬液中细胞数量的一种方法。一般利用细胞计数板（即血细胞计数板）进行（见右图）。既可用于分离（散）细胞培养接种前计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，也可用于对培养物的细胞数量进行计数。计算公式：细胞密度＝(4大格细胞总数／4)*10,000(个／ml)大格对于压线的细胞只计算在上线和左线者培养物的观察检测方法1.活细胞的观察检测方法1.3细胞生长曲线细胞生长曲线（cellgrowthcurve）是观测细胞在一代生存期内的增生过程的重要指标，它以培养时间（d)为横坐标、细胞密度为纵坐标作坐标图。制作细胞生长曲线的过程：（1）培养细胞首先在培养板的21个孔内分别接种相同数量的细胞（如果使用培养瓶，则需接种21瓶）。计数并记录接种的细胞悬液之密度。接种时间记为0h。（2）计数细胞密度从接种时间算起，每隔24h计数3孔（瓶）内的细胞密度，算出平均值。为提高准确率，对每孔（瓶）细胞可计数2～3次。如此操作至第七天结束。（3）绘制曲线以培养时间（d)为横坐标、细胞密度为纵坐标，将全部结果在坐标纸上绘图，即得所培养细胞的生长曲线（见下图所示）。培养物的观察检测方法1.活细胞的观察检测方法1.3细胞生长曲线培养物的观察检测方法1.活细胞的观察检测方法1.4体外活体染色观察与活体染料体外活体染色就是在体外条件下用某种染色剂（即活体染料）对活的组织或细胞进行染色，而不影响活细胞的生命活动的方法。利用这种方法，可以对培养物进行染色观察，经染色的培养物还可以继续进行培养。能够使活细胞着色而不影响细胞生命的染料就是活体染料。真正的活体染料，既能固着在活细胞的某种结构上，又对细胞本身不产生明显的毒性作用。活体染料可分为碱性活体染料和酸性活体染料两大类：培养物的观察检测方法1.活细胞的观察检测方法1.4体外活体染色观察与活体染料体外活体染色一般使用碱性活体染料（带正电荷）。酸性活体染料多用于体内活体染色，体外活细胞难以着色。1.4.1活体染料的类别培养物的观察检测方法1.活细胞的观察检测方法1.4体外活体染色观察与活体染料1.4.2工作浓度体内活体染色时，注射的活体染料溶液浓度可高达1％甚至2％。而体外活体染色一般使用2‰、1‰甚至0.1‰,0.05‰或者更淡的染液。以1‰～0.3‰的浓度较为合适。可以用平衡盐溶液、PBS或生理盐水等配制。培养物的观察检测方法1.活细胞的观察检测方法1.4体外活体染色观察与活体染料1.4.3染色步骤1)吸去培养液，将培养物用平衡盐溶液,PBS或生理盐水稍事洗涤。2)加入活体染料溶液，在培养箱内静置染色0.5h或者1～2h。3)在显微镜下观察（细胞将被淡染）或作其它处理（作选择性标记等）。4)倾去染液。用平衡盐溶液、PBS或生理盐水洗涤。5)加入培养液，继续培养。培养物的观察检测方法1.活细胞的观察检测方法1.５活细胞的染料排除检测法由于死细胞的细胞膜通透性发生改变，某些染料可大量进入却不被排出，因而细胞呈色。而活细胞反之，能排出进入细胞内的染料，因而不易着色。此法的原理即是利用死、活细胞对染料的不同反应而区分开两种细胞。1．5.1台盼蓝排除检测法：（1）2％台盼蓝溶液的配制：称取2g台盼蓝(trypanblue），加少量双蒸水研磨粉碎后，再加水至50ml，离心后取上清液，再加入1.8％NaCI溶液至100ml，即成工作液。（2）活体染色与细胞计数1)将1滴细胞悬液（贴壁细胞可经0.25%胰蛋白酶溶液消化后，吹打制成细胞悬液）与2滴台盼蓝液混合后，滴入细胞计数板。2)2min后，在显微镜下计数至少200个细胞。未着色的为活细胞，呈蓝色的为死细胞。计算活细胞的百分比。培养物的观察检测方法1.活细胞的观察检测方法1.５活细胞的染料排除检测法1．5.2溴比乙锭和碘化丙锭排除检测法：溴比乙锭（ethidiumbromide,EB)和碘化丙锭（propidiumiodine,PI）均为荧光染料，可与DNA特异性结合。（1）染液配制：取EB或PI5mg,枸橼酸钠0.1g,NP-400.3ml,共溶于100ml蒸馏水中。避光保存。（2）荧光染色与计数：取细胞悬液和EB或PI染液各0.5ml，混匀。静置10～30min后在荧光显微镜下计数。发橙红色荧光者为死细胞。也可用流式细胞仪测定，激发光波长为488nm。2h内荧光保持稳定。培养物的观察检测方法1.活细胞的观察检测方法1.５活细胞的染料排除检测法培养物的观察检测方法1.活细胞的观察检测方法1.6细胞增殖活性测定的3H-TdR掺入法细胞增殖前必须复制DNA，而胸腺嘧啶是DNA的特异碱基。用3H标记的胸腺嘧啶脱氧核苷（TdR）掺入到新合成的DNA中后，会均匀地分布于子细胞中。此时只要测定3H的放射性脉冲数便可比较不同细胞的增殖活性。1.7细胞活力测定的MTT比色法此法的原理是活细胞的线粒体脱氢酶能将染料MTT（二甲基噻唑二苯基四唑溴盐）转变为不可溶性的紫色甲鐟(formazan)颗粒，后者被酸性异丙醇溶解后所呈现的色度（用OD值表示）反映出活细胞的代谢水平。死亡细胞则无此酶活性。培养物的观察检测方法2.普通染色观察苏木精—伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色和Giemsa染色是观察培养细胞一般形态的最常用方法，也是把细胞作为标本保存的主要方法。对于贴壁培养的细胞，以生长于盖玻片和塑料培养瓶壁者便于操作。固定前先用Hanks液、PBS,BSS或生理盐水清洗培养物2次，去除妨碍染色的血清。固定后可将盖玻片用树胶贴于载玻片上，以利操作。对于悬浮培养细胞，须先经离心沉淀(1000r/min,10min),弃上清液后（留少量液体），将细胞悬液滴于玻片上做成涂片，冷风吹干。培养物的观察检测方法3.细胞化学技术细胞化学技术（cytochemistry）可特异性地显示细胞内的细胞器和化学成分，其技术成熟，效果稳定，费用较低，即使在免疫细胞化学畅行的今天，也仍不失为有效的研究技术。3.1酸性磷酸酶3.2葡萄糖—6—磷酸酶3.3琥珀酸脱氢酶3.4DNA与RNA的吖啶橙荧光染色法3.5DNA的富尔根（Feulgen)染色法几种最常用的方法：培养物的观察检测方法3.细胞化学技术3.1酸性磷酸酶酸性磷酸酶（acidphosphatase）是溶酶体的特征性酶，故常用此法作为研究溶酶体的指标。其原理是该酶在酸性条件下分解甘油磷酸钠，释放出的磷酸根与醋酸铅的醋酸根置换，形成磷酸铅，后者与硫化胺作用，最终形成棕黑色的硫化铅沉淀物，于镜下清晰可辨。3.2葡萄糖—6—磷酸酶葡萄糖-6一磷酸酶（glucose-6-phosphatase)为滑面内质网的标志酶。琥珀酸脱氢酶（succinodehydrogenase）是线粒体的标志酶，参与细胞有氧呼吸，其活性与线粒体活性平行，在癌细胞中其活性常减弱。3.3琥珀酸脱氢酶培养物的观察检测方法3.细胞化学技术3.4DNA与RNA的吖啶橙荧光染色法3.5DNA的富尔根（Feulgen)染色法吖啶橙（acridineorange,AO）与细胞内的DNA,RNA都有亲和力，但结合后却发不同颜色的荧光，DNA呈亮绿色，而RNA呈橘黄色至火红色。此法极简便快捷，并可染活细胞与固定细胞。此法原理是：在60℃条件下DNA分子中的嘌呤碱和脱氧核糖的连键可被1mol/L盐酸水解打开，游离出的脱氧核糖醛基能与希夫（Schiff)试剂结合，形成紫红色复合物。在此过程中RNA不受影响，故染色具DNA特异性。准确的温度和盐酸浓度，适宜的水解时间是成功的关键。水解过度或不足均降低染色强度。培养物的观察检测方法4.免疫细胞化学技术免疫细胞化学（immunocytochemistry,ICC）是利用抗原与抗体特异性结合的原理，以标记抗体作为探针来显示细胞内抗原成分，主要是多肽与蛋白质（包括受体、酶、分泌物前体等各种基因表达产物），对其进行定位、定性及定量的研究。在体外培养技术方面，ICC是鉴定细胞类型的可靠手段。4.1常用免疫细胞化学技术原理4.2常用的显色标记物4.3免疫细胞化学方法及标记物的选择4.4免疫细胞化学的一般问题4.5免疫细胞化学染色的典型程序培养物的观察检测方法4.免疫细胞化学技术4.1常用免疫细胞化学技术原理标记物二抗一抗抗原标记物SPA一抗抗原标记链亲和素生物素二抗一抗抗原PAP复合物二抗一抗抗原间接法SPA法LSAB法PAP法常用免疫细胞化学技术原理示意图4.1.1间接法indirectmethod4.1.2过氧化物酶—抗过氧化物酶法peroxidase-antiperoxidase,PAP法4.1.3标记链亲和素—生物素法labeledstreptoavidinbiotin,LSAB法4.1.4葡萄球菌蛋白A法staphylococalproteinA,SPA法培养物的观察检测方法4.免疫细胞化学技术4.1常用免疫细胞化学技术原理4.1.1间接法最原始的ICC技术是在获得针对某抗原的特异性抗体后，各实验室自行对该抗体进行标记，然后用标记抗体直接进行免疫染色。这种方法虽然步骤不多，然而标记抗体操作复杂，质量也不易保持稳定。由于种间的免疫球蛋白互具抗原性，这样可以制备如抗小鼠IgU的兔抗体，前者简称一抗，后者简称二抗。二抗可以与所有特异性不同的小鼠一抗结合，只需要标记二抗便解决了标记不同一抗的麻烦。目前，标记的二抗已完全商品化。这样，用二抗间接显示抗