分子诊断第一章至第13章

第一章绪论分子生物学的定义：分子生物学（molecularbiology）是研究核酸、蛋白质等生物大分子的结构与功能，并从分子水平上阐述核酸与蛋白质、蛋白质与蛋白质之间相互作用的关系及其基因表达调控机制的一门学科。广义分子生物学：包括对核酸、蛋白质等生物大分子结构与功能的研究，以及从分子水平上阐明生命的现象和生物学规律。狭义分子生物学：偏重于核酸的分子生物学。主要研究基因或DNA结构与功能、遗传信息的表达及其调控机制等，也涉及到这些过程中相关蛋白质和酶的结构与功能的研究。分子生物学研究的内容：按照狭义分子生物学的定义，可将现代分子生物学的研究内容概括为：1.基因与基因组的结构与功能。2.遗传信息的传递。3.基因表达调控机制。4.基因工程。5.结构分子生物。现代分子生物学的发展：DNA重组技术：工具酶的发现、DNA的体外连接、载体的构建。核酸分析技术：核酸杂交技术、DNA序列分析技术、PCR技术。基因组研究：人类基因组计划、模式生物基因组。基因表达调控：操纵子调控机制、真核基因调控方式、小分子RNA的研究。细胞信号转导研究：G蛋白偶联信号转导、各种受体分子的研究。技术应用成果：癌基因的发现、转基因技术、基因诊断和治疗、生物药物生产。分子生物学发展趋势：功能基因组学←蛋白质组学→生物信息学。医学分子生物学定义：定义：主要研究人体生物大分子的结构、功能、相互作用及其同疾病发生、发展的关系。研究内容：主要研究人体发育、分化和衰老、细胞增殖调控、三大功能调控系统（神经、内分泌和免疫）的分子生物学基础；基因结构异常或调控异常与疾病发生、发展的关系；基因诊断、治疗和预防；生物制药。在基础医学中的应用：在分子水平上对人的生理功能和病理机制进行研究；出现新的边缘学科——分子生理学、分子药理学、分子病理学、分子遗传学、分子免疫学、分子病原学、分子肿瘤学、分子遗传学、分子神经科学等；各学科在分子水平上进行整合的趋势；形成“反向遗传学”研究途径。在疾病诊断中的应用：以核酸、蛋白质为分析材料；应用分子生物学技术分析基因结构、表达变化及功能改变；检测疾病基因的存在及状态；对遗传性疾病、传染性疾病、肿瘤及其他分子疾病进行诊断。在临床治疗中的应用：正常基因导入细胞替代或补充缺陷基因；疾病基因的封闭、敲除；非目标基因产物的协同作用。分子诊断的理论基础：病原生物与感染性疾病：①病原生物基因在人体内的复制②病原生物基因与人体染色体整合，致宿主基因结构异常。基因变异与分子疾病：基因变异：单基因疾病、多基因疾病、线粒体遗传病、恶性肿瘤。基因多态性分析：疾病诊断和遗传咨询、器官移植配型和个体识别、多基因病的诊断、基因定位和疾病相关性分析。基因表达异常：mRNA表达量异常、mRNA转录及加工缺陷。第二章核酸的结构和功能核酸：是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，携带和传递遗传信息。核酸的分类及分布：脱氧核糖核酸：90%以上分布于细胞核，其余分布于线粒体、叶绿体、质粒等。携带遗传信息，决定细胞和个体的基因型(genotype)。核糖核酸：分布于胞核、胞液。参与细胞内DNA遗传信息的表达。某些病毒RNA也可作为遗传信息的载体。第一节核苷酸的组成及结构一、核酸的化学组成元素组成：C、H、O、N、P（9－10%）分子组成：碱基(base)：嘌呤碱、嘧啶碱；戊糖(ribose)：核糖、脱氧核糖；磷酸(phosphate)。核苷酸水解产物：核苷酸包括磷酸和核苷，核苷包括碱基和戊糖。二、核苷酸的结构1.核苷的形成：碱基和核糖（脱氧核糖）通过糖苷键连接形成核苷（脱氧核苷）。核苷：AR,GR,UR,CR脱氧核苷：dAR,dGR,dTR,dCR核苷：戊糖与含氮碱基脱水缩合而生成。假尿嘧啶（Ψ）核苷的糖苷键不是C-N键，而是C-C键。2.核苷酸的结构与命名：核苷（脱氧核苷）和磷酸以磷酸酯键连接形成核苷酸（脱氧核苷酸）。核苷酸：AMP,GMP,UMP,CMP脱氧核苷酸：dAMP,dGMP,dTMP,dCMP。体内重要的游离核苷酸及其衍生物：多磷酸核苷酸：NMP，NDP，NTP；环化核苷酸：cAMP，cGMP；含核苷酸的生物活性物质：NAD+、NADP+、CoA-SH、FAD等都含有AMP。3.核苷酸的连接：核苷酸之间以3’,5’-磷酸二酯键连接形成多核苷酸链，即核酸。三、核酸的一级结构定义：核酸中核苷酸的排列顺序。由于核苷酸间的差异主要是碱基不同，所以也称为碱基序列。核酸具有方向性，一端称为5’-端，另一端称为3’-端。第二节DNA的空间结构与功能一、DNA的二级结构——双螺旋结构㈠DNA双螺旋结构的研究背景：碱基组成分析Chargaff规则：[A]=[T][G][C]；碱基的理化数据分析A-T、G-C以氢键配对较合理；DNA纤维的X-线衍射图谱分析。㈡DNA双螺旋结构模型要点：DNA分子是反向平行的互补双链结构；骨架：-脱氧核糖-磷酸-碱基：“挂”在主链骨架上。DNA分子为右手螺旋结构。螺旋直径为2nm，形成大沟及小沟。相邻碱基平面距离0.34nm，螺旋一圈螺距3.4nm，一圈10对碱基。维系键：疏水作用力，氢键。碱基堆积力：碱基平面之间的疏水作用力。氢键：垂直螺旋轴居双螺旋内側，与对側碱基形成氢键配对。碱基互补配对：A=T;GC；碱基互补配对是半保留复制的基础。㈢DNA双螺旋结构的多样性二、DNA超螺旋结构及在染色质中的组装㈠DNA的超螺旋结构：超螺旋结构：DNA双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。正超螺旋：盘绕方向与DNA双螺旋方同相同。负超螺旋：盘绕方向与DNA双螺旋方向相反。意义：DNA超螺旋结构整体或局部的拓扑学变化及其调控对于DNA复制和RNA转录过程具有关键作用。㈡原核生物DNA的高级结构㈢DNA在真核生物细胞核内的组装：真核生物染色体由DNA和蛋白质构成，其基本单位是核小体。核小体的组成：DNA：约200bp组蛋白：H1、H2A，H2B、H3、H4。真核生物中的核小体结构：DNA双螺旋形成超螺旋结构，再与核内的蛋白质结合，形成核小体的结构。DNA缠绕八聚体1.75圈，然后与H1连接，形成串珠状结构。意义：有规律压缩体积，减少占用的空间。三、DNA的功能DNA的基本功能是以基因的形式荷载遗传信息，并作为基因复制和转录的模板。它是生命遗传的物质基础，也是个体生命活动的信息基础。基因从结构上定义，是指DNA分子中的特定区段，其中的核苷酸排列顺序决定了基因的功能。基因：DNA分子中具有特定生物学功能的片段。基因组：一个生物体的全部DNA序列。因组的大小与生物的复杂性有关，如病毒SV40的基因组大小为5.1×103bp，大肠杆菌为5.7×106bp，人为3×109bp。第三节RNA的结构与功能RNA通常以单链形式存在，但也可形成局部的双螺旋结构。RNA分子的种类较多，分子大小变化较大，功能多样化。RNA的种类、分布：细胞质RNA：mRNA、tRNA、rRNA、胞浆小RNA；细胞核RNA：hnRNA、核酶RNA、SnRNA；线粒体RNA：mtmRNA、mttRNA、mtrRNA。一、信使RNAmRNA结构特点：1.大多数真核mRNA的5´末端均在转录后加上一个7-甲基鸟苷，同时第一个核苷酸的C´2甲基化，形成帽子结构：m7GpppN-。2.大多数真核mRNA的3´末端有一个多聚腺苷酸(polyA)结构，称为多聚A尾。帽子结构和多聚A尾的功能：mRNA核内向胞质的转位、mRNA的稳定性维系、翻译起始的调控。编码区：mRNA分子中每三个相邻的核苷酸组成一组，在蛋白质翻译合成时代表一个特定的氨基酸，这种核苷酸三联体称为遗传密码。功能：为蛋白质的合成提供模板。mRNA的功能：为蛋白质的合成提供模板。把DNA所携带的遗传信息，按碱基互补配对原则，抄录并传送至核糖体，用以决定其合成蛋白质的氨基酸排列顺序。二、转运RNAtRNA的一级结构特点tRNA是分子最小(70～90个核苷酸）；含10-20%稀有碱基，如DHU、等；3´末端为—CCA-OH(氨基酸臂）；5´末端大多数为G；具有TC。tRNA的二级结构——三叶草形：氨基酸臂：DHU环、反密码环、额外环、TΨC环。3’－OH端可以结合氨基酸，反密码环可以与mRNA上的密码子配对，将合适的氨基酸携带到合适的位置。tRNA的功能：特异性活化、转运氨基酸；识别mRNA密码子，参与蛋白质合成。命名原则：tRNATyr：可以和Tyr结合的tRNA；Tyr-tRNATyr：结合了Tyr的tRNA。tRNA的三级结构——倒L形三、核蛋白体rRNA是细胞中含量最多的RNA，占总量的80%。rRNA的功能：参与组成核蛋白体，作为蛋白质生物合成的场所。rRNA的种类（根据沉降系数）：真核生物：5SrRNA、28SrRNA、5.8SrRNA、18SrRNA原核生物：5SrRNA、23SrRNA、16SrRNA。核蛋白体的组成原核生物（以大肠杆菌为例）真核生物（以小鼠肝为例）小亚基30S40SrRNA16S1542个核苷酸18S1874个核苷酸蛋白质21种占总重量的40%33种占总重量的50%大亚基50S60SrRNA23S5S2940个核苷酸120个核苷酸28S5.85S5S4718个核苷酸160个核苷酸120个核苷酸蛋白质31种占总重量的30%49种占总重量的35%四、其他小分子RNA及RNA组学SnmRNAs：除了上述三种RNA外，细胞的不同部位存在的许多其他种类的小分子RNA，统称为非mRNA小RNA(smallnon-messengerRNAs,snmRNAs)。snmRNAs的种类：核内小RNA、核仁小RNA、胞质小RNA、催化性小RNA、小片段干涉RNA。snmRNAs的功能：参与hnRNA和rRNA的加工和转运。RNA组学：RNA组学研究细胞中snmRNAs的种类、结构和功能。同一生物体内不同种类的细胞、同一细胞在不同时间、不同状态下snmRNAs的表达具有时间和空间特异性。第四节核酸的理化性质一、核酸的一般理化性质核酸具有酸性；DNA分子粘度大；RNA分子粘度小；能吸收紫外光，最大吸收峰为260nm。可用于核酸的定性和定量测定。核酸的大小表示：碱基对bp；长度单位um；分子量Da；核酸的脆性。OD260的应用：1.DNA或RNA的定量：OD260=1.0相当于50μg/ml双链DNA，40μg/ml单链DNA（或RNA），20μg/ml寡核苷酸。2、判断核酸样品的纯度：DNA纯品：OD260/OD280=1.8RNA纯品：OD260/OD280=2.0二、DNA的变性定义：在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。变性后其它理化性质变化：增色效应、粘度下降、比旋度下降、浮力密度升高、酸碱滴定曲线改变、生物活性丧失。DNA变性的本质是双链间氢键的断裂。解链曲线：如果在连续加热DNA的过程中以温度对A260（absorbance，A，A260代表溶液在260nm处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解链曲线。Tm：变性是在一个相当窄的温度范围内完成，在这一范围内，紫外光吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度，又称融解温度(meltingtemperature,Tm)。Tm的高低与DNA分子中G+C的含量有关，G+C的含量越高，则Tm越高。三、DNA的复性DNA复性(renaturation)的定义：在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火。减色效应：DNA复性时，其溶液OD260降低四、分子杂交与探针技术两条来源不同的单链核酸（DNA或RNA），只要它们有大致相同的互补碱基顺序，在适宜的条件（温度及离子强度）下，经退火处理即可复性，形成新的杂种双螺旋，这一现象称为核酸的分子杂交。核酸杂交可以是DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交，RNA-RNA杂交。不同来源的，具有大致相同互补碱基顺序的核酸片段称为同源顺序。探针技术：利用核酸的分子杂交，可以确定或寻找不