冰冻切片protocol1

冰冻切片protocol1.材料及方法1.1实验材料冰冻切片1.2主要试剂0.1moL/LPH=7.4的PBS缓冲液4%多聚甲醛溶液50%蔗糖溶液（现用现配）组织冰冻切片包埋剂20%氨基甲酸乙酯多聚赖氨酸包恩氏液1.3用品与仪器烧杯（1000ml100ml50ml），量筒（1000ml10ml），漏斗，滤纸，玻璃棒，载玻片，盖玻片，滴管，镊子，标签纸，玻璃分针、手术刀片、手术剪、眼科剪、毛剪刀、托盘、灌注针头、注射器（50ml）、三通接头、表面皿。仪器见表1所示。表1主要仪器型号表仪器名称型号制造厂家冷冻切片机CM1900LEICA电子天平PL1501-SMettlerToledo梅特勒-托利多中国地区显微镜XSZ-H1.4实验方法将昆明小鼠通过注射乌拉坦（氨基甲酸乙酯）麻醉后，进行心脏灌注生理盐水和多聚甲醛，分别取其胰腺和坐骨神经、脑，用包恩氏液和4%多聚甲醛两种方法来固定，然后进行HE染色，最后用显微镜进行镜检观察分析。2实验步骤流程2.1组织的取材与固定2.1.1固定液的配制1、包恩氏液（共配200ml）：2、0.1mol/LPBS缓冲液：3、多聚甲醛（共配200ml）4、脱水30%蔗糖2.1.2手术取材及固定将昆明小鼠进行腹腔注射乌拉坦(100g/ml)麻醉后，进行心脏灌注,生理盐水（50ml）和多聚甲醛（50ml），分离坐骨神经、脑和胰腺，PBS洗3次，各5分钟（或洗一次20分钟），将坐骨神经包进大脑，用4%多聚甲醛固定坐骨神经（2h以上），包恩氏液固定胰腺（3h以上），PBS洗3次，各5分钟（或洗一次20分钟）。2.2脱水脱水是应用脱水剂将组织内的水分置换出来，同时组织又不出现收缩变形等人工改变。我们选择蔗糖为脱水剂。2.2.1溶液配制30%蔗糖溶液2.2.2脱水步骤用30%蔗糖溶液脱水，4℃冰箱内过夜，至组织沉底为止。PBS洗三次，各5分钟（或洗一次20分钟）。2.3包埋用包埋剂包埋，锡纸包好，放于-20℃下冰冻保存。2.4切片、粘片及烤片切片是将组织标本制成很薄的片子，以便染色后，在显微镜下能观察细胞的形态结构和病变情况，是制片中的重要一环。切片方法是：将切片用具备好，修正并固定好包埋块，即可切片。本实验根据实际情况选择切片厚度为10μm左右，放入-20℃保存。染色前从冰箱拿出，烤片40℃-45℃30min，PBS浸泡30min，水洗30s，进行染色。整理：李青