食源性致病菌血清学诊断技术

食源性致病菌血清学检验技术福建省疾病预防控制中心马群飞内容一、血清学检验的概念二、血清学检验的类型三、国家标准使用的血清学检验技术四、血清学检验质量控制基本概念：血清•血液凝固析出的淡黄色透明液体。血液放入试管中，不加抗凝剂，则血液迅速凝固，形成胶冻。凝血块收缩，其周围析出血清，也可于凝血后经离心取得。在凝血过程中，纤维蛋白原转变成纤维蛋白块，所以血清中无纤维蛋白原，这一点是与血浆最大的区别。而在凝血反应中，血小板释放出许多物质，各凝血因子也都发生了变化。这些成分都留在血清中并继续发生变化，如凝血酶原变成凝血酶，并随血清存放时间逐渐减少以至消失。这些也都是与血浆区别之处。但大量未参加凝血反应的物质则与血浆基本相同。血清蛋白•为避免抗凝剂的干扰，血液中许多化学成分的分析，都以血清为样品。血清学检验的概念•利用抗原-抗体反应的显著特异性，进行细菌的鉴别和血清学定型，已有半个多世纪的历史。细菌菌体或鞭毛等抗原的特异性抗体的存在，使得人们可以建立一些快速方法来检测以食品为载体的病原。血清学检验的概念•体外抗原抗体反应中的抗体主要来源于血清，其检测多以血清为实验材料，故体外抗原抗体反应亦称为血清学反应（serologicreaction）或血清学试验、血清学检验。血清学检验的概念•血清学检验指根据抗原与相应的抗体在适宜的条件下，能在体外发生特异性结合的原理，在体外用已知抗体（或抗原）检测抗原（或抗体）。•血清学检验是微生物学检验的重要方法之一。也是细菌、病毒性疾病诊断和病原菌鉴定的重要手段之一。血清学反应的一般特点•（1）抗原与抗体的结合具有高度特异性，但当两种不同抗原分子上有共同抗原决定簇存在时，则与抗体结合时可出现交叉反应。•（2）抗原与抗体结合是分子表面的结合。两者的结合相当稳定，但是可逆的，在一定条件下可发生解离，解离后的抗原、抗体性质不变。•（3）抗原、抗体的结合按一定比例，只有在比例适当时才会出现可见反应。若抗原、抗体比例不合适，就会有未结合的抗原或抗体游离于上清液中，不能形成大块免疫复合物，故不能呈现可见反应。•（4）血清学反应可分两个阶段进行，但其间无严格界限。在第一阶段，抗原和抗体特异性结合，此阶段反应很快，几秒钟或几分钟即可完成，但无可见反应；在第二阶段，反应进入可见阶段，反应进行的很慢，往往需几分钟甚至几十分钟以至数日方可完成。而且常受电介质、温度、pH等诸多外界因素的影响。血清学检验的类型•血清学试验可分为血清学鉴定和血清学诊断两部分。血清学试验既可定性，又可定量。•用已知抗体（即含特异抗体的免疫血清或单克隆抗体等）检测标本中或分离培养物中未知细菌的种、型或细菌抗原，称为血清学鉴定；•而用已知细菌或特异性抗原检测患者血清中有无相应抗体及其效价的动态变化，作为某些感染性疾病的辅助诊断，称为血清学诊断。血清学鉴定•血清学鉴定常用的血清学试验是凝集试验（直接凝集试验和间接凝集试验）、沉淀试验、荚膜肿胀试验和毒素-抗毒素中和试验等。凝集反应一、直接凝集反应二、间接凝集反应•1、正向间接凝集反应•2、反向间接凝集反应•3、凝集抑制反应•4、协同凝集反应颗粒性抗原凝集素直接凝集反应•直接凝集反应指颗粒性抗原与相应抗体直接结合出现的凝集现象。（一）玻片凝集试验•一种常规的定性试验方法。原理是用已知抗体来检测未知抗原。常用于鉴定菌种、血型。取已知抗体（诊断血清）滴加在载玻片上，直接从培养基上刮取待检菌混匀于诊断血清中，数分钟后，如出现细菌凝集成块或肉眼可见的颗粒，即为阳性。方法简便、快速、特异性强，现行国标用于沙门氏菌、志贺氏菌、致病性大肠埃希氏菌等的鉴定，但不能进行定量测定。（一）玻片凝集试验•如将含有沙门氏菌抗体的血清与待检菌液各一滴，在玻片上混匀，数分种后若出现肉眼可见的凝集块，即为阳性反应，证明该菌是沙门氏菌。（一）玻片凝集试验•自临床初分离的细菌中，有些细菌表面含有某种表面抗原(如伤寒沙门氏菌的Vi抗原和志贺氏菌属的K抗原等)，这些抗原能阻止菌体抗原(O抗原)与相应抗体发生凝集反应，从而导致错误的判定。此时应将菌悬液于100℃中隔水煮沸(Vi抗原100℃30min、K抗原100℃1h)，待细菌表面抗原破坏后，再进行试验。（一）玻片凝集试验用于鉴定细菌的诊断血清有以下几类：1、多价诊断血清：即混合诊断血清，血清中含有两种以上细菌的相应抗体。一般用于细菌定属或群。2、单价诊断血清：仅含一种(或型)细菌的相应抗体。可用于细菌的定种(或型)。3、因子诊断血清：仅含一种细菌的型特异性抗体的诊断血清称为因子血清。可用于细菌分型。玻片凝集结果观察沙门氏菌的生物学性状•目前根据对某一特定O抗原共同具有的标准，将沙门氏菌属分为A～Z和O51～O67共42个O群，58种O抗原，63种H抗原。•到1987年底为止，已有2213个血清型。•我国已发现26个菌群、161个血清型。沙门氏菌的血清分型•沙门氏菌主要有O和H两种抗原。少数菌具有表面抗原Vi。•在这些菌群中，对人致病的沙门氏菌，通常为属于A～F各O群的常见菌型。•故用A～F多价O血清对沙门氏菌进行的菌型鉴定，只是对于O抗原的第一步鉴定。•若待测菌型不属于A到F群，仍要继续使用其他沙门氏菌因子血清中的多价O血清继续鉴定。而在确定了所属O群之后，还要进行H抗原的鉴定。必要时，还需进行Vi抗原的鉴定。沙门氏菌血清试验致病性的沙门氏菌绝大多数血清归在A-F群内，所以检出疑似菌株应先凝集A-F群O多价血清，若凝集可按常见O因子检出频率，按照O4→O10→O9→O7→O8→O19→O2→O11顺序凝集，可节省时间。H抗原可先凝集H多价1～H多价4，再逐个凝集某个H多价凝集所含的H单因子血清。伤寒和丙型副伤寒杆菌在A-F群多价血清不凝集情况下，还应做Vi血清凝集。沙门氏菌血清学试验结果观察（二）试管凝集法•一种定量试验方法。多用已知抗原来检测血清中有无相应抗体及其含量。常用于协助诊断某些传染病及进行流行病学调查。如肥达氏反应就是诊断伤寒、副伤寒的试管凝集试验。因为要测定抗体的含量，故将待检查的血清用等渗盐水倍比稀释成不同浓度，然后加入等量抗原，37℃或56℃，2～4h观察，血清最高稀释度仍有明显凝集现象的，为该抗血清的凝集效价。间接凝集反应•是将可溶性抗原或抗体吸附于某种与免疫无关一定大小的颗粒载体表面，制成致敏载体，再与相应抗体或抗原作用，在电解质存在的适宜条件下，被动地使致敏载体凝集，称为间接（或被动）凝集反应。•根据载体不同，还可以分为乳胶凝集、血球凝集、炭凝集、SPA协同凝集等。间接血凝试验示意图－：红细胞沉积于孔底；＋：红细胞沉积于孔底，周围有散在少量凝集；＋＋：红细胞形成层凝集，边缘较松散；＋＋＋：红细胞形成片层凝集，面积略大；＋＋＋＋：红细胞形成片层凝集，均匀布满孔底，或边缘皱缩如花边状凝集反应可溶性抗原载体颗粒正向间接凝集反应•即将已知可溶性抗原吸附于载体颗粒上，然后与相应抗体结合产生颗粒凝集现象，用以检测未知抗体。抗体可溶性抗原载体颗粒反向间接凝集反应•是将已知抗体吸附于载体颗粒表面，以检测相应可溶性抗原的凝集反应。空肠弯曲菌的间接血凝试验间接血凝试验（IHA）是将抗原（或抗体）包被于红细胞表面，成为致敏的载体，然后与相应的抗体（或抗原）结合，从而使红细胞聚集在一起，出现可见的凝集反应。葡萄球菌肠毒素的乳胶凝集试验①乳胶敏化抗体加盐水，再加等体积乳胶制剂，混匀孵育，然后加牛血清白蛋白。②待检菌液制备琼脂上挑取待检菌落，制成菌悬液，离心沉淀细胞，上清液待检。③正式试验在玻片上加待检上清和致敏乳胶，混匀，轻轻摇动3min，在斜射光下观察结果，判定标准同一般凝集试验。灵敏度高，且无假阳性结果。间接凝集抑制反应•是将已知抗体或可溶性抗原先与被测的抗原或抗体混合，然后加入有关抗原或抗体致敏的载体颗粒，如已知抗体或可溶性抗原与被测的抗原或抗体相结合，则不出现颗粒凝集现象。故也可称为正向间接凝集抑制试验或反向间接凝集抑制试验。凝集凝集抑制待检样品待检样品间接凝集抑制反应协同凝集试验•使用载体是含SPA（葡萄球菌A蛋白）金黄色葡萄球菌。SPA能与人及多种哺乳动物血清中IgG类抗体的Fc段结合，IgG的Fc段与SPA结合后，IgG的两个Fab段暴露于葡萄球菌菌体的表面，并仍保持正常的抗体活性，当结合于葡萄球菌表面的已知抗体与相应细菌、病毒或毒素抗原接触时，则出现肉眼可见的凝集现象。方法简便、快速、敏感性高，易于观察结果，已广泛用于细菌的快速鉴定和分群（型），如脑膜炎奈瑟菌、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、溶血性链球菌、布鲁氏菌、沙门氏菌及志贺氏菌等。沉淀反应•可溶性抗原（如细菌的培养滤液、含细菌的患者血清、脑脊液及组织浸出液等）与相应抗体相混合，在比例适合和适量电解质的存在等条件下，形成肉眼可见的沉淀物，称沉淀反应。利用沉淀反应进行血清学试验的方法称为沉淀试验。沉淀反应有环状、絮状和琼脂扩散法3种基本类型。＋－抗血清抗原絮状沉淀反应•指可溶性抗原与抗体在试管内以适当比例混合后，在电解质存在的条件下，出现絮状的沉淀物。•将已知抗原与抗体在试管（如凹玻片）内混匀，如抗原抗体对应，而又二者比例适当时，会出现肉眼可见的絮状沉淀，此为阳性反应。＋－抗原抗体环状沉淀反应•将已知的抗血清加于细管中，然后沿管壁徐徐加入已适当稀释的待测抗原溶液，使成为分界清晰的二层，孵育5~30min后，如在两液面交界处形成肉眼可见的白色环状沉淀物为阳性反应。琼脂扩散试验•用琼脂制成半固体的凝胶，使抗原和抗体在凝胶中扩散，若两者比例适当，则在相遇处形成肉眼可见的白色沉淀物（线或环），为阳性反应。每对抗原抗体可形成一条沉淀线。有几对抗原抗体，就可分别形成几条沉淀线。由于方法简便易行，常用于测定分析和鉴定复杂的抗原成分。•(1)单向琼脂扩散试验•(2)双向琼脂扩散试验•(3)对流免疫电泳•(4)免疫电泳免疫扩散技术免疫电泳技术单向扩散试验双向扩散试验火箭电泳对流电泳免疫电泳扩散试验•单向扩散试验是一种定量试验•双向扩散试验多用于定性试验。单向扩散试验•将抗体预先在琼脂中混匀，制成凝胶板，凝固后在琼脂上打孔，孔中加入待试抗原，经一定时间扩散后，若抗原与抗体对应，则在孔周围比例适当处形成白色沉淀环。双向扩散试验•先制备琼脂凝胶板，待凝固后，根据需要在其上面多少个孔，孔间保持一定距离，然后将抗原和抗体分别注入小孔中，使两者相互扩散。如抗原与抗体相对应，浓度比例适当，经一定时间扩散后，在抗原抗体孔之间出现清晰的白色沉淀线。一对相应的抗原抗体只能形成一条线。双向扩散试验•因此，根据沉淀线的数目即可推测抗原液中有多少种抗原成分，根据沉淀线融合与否及交叉关系，还可鉴定两种抗原是否完全相同，还是部分相同。本法可用于检测未知抗原或抗体、分析和鉴定抗原成分、检测抗体或抗原的纯度、滴定抗血清的效价等。缺点是需时长，敏感性差。抗原分子量＞抗体分子量抗原分子量＝抗体分子量抗原分子量＜抗体分子量抗原、抗体相对含量测定抗原、抗体相对分子量分析抗原性质分析•耐热，经100℃煮沸30min不被破坏，也不受胰蛋白酶的影响。食物中的肠毒素耐热性更强，一般烹调温度不能将其破坏。218～248℃的油中需30min才能被破坏。可引起急性胃肠炎。以剧烈呕吐为特征。葡萄球菌肠毒素•根据肠毒素的血清型，可分A、B、C（C1、C2）、D、E5个型。A型肠毒素引起的食物中毒较多，约占50%左右。其他依次为D、C、B和E型。也有A＋D、A＋B、A＋C、B＋C等。葡萄球菌肠毒素葡萄球菌肠毒素双向琼脂扩散•该方法也用在GB/T4789.6－2003肠毒素检验。溶血反应与补体结合试验一、溶血反应溶血反应与补体结合试验二、补体结合试验是一种在补体参与下，以绵羊红细胞和溶血素为指示系统的抗原抗体反应。血清学诊断•血清学诊断是指用已知抗原或已知抗体检测患者血清中相应抗体的方法，以诊断感染性疾病。•抗体效价必须明显高于正常人群的水平或随病程递增才有诊断价值。多数血清学诊断需取患者急性期和恢复期双份血清标本，若后者的抗体效价比前者升高4倍或4倍以上才有诊断意义。•在患者血清中检出病原微生物的抗原