第七章-层析技术

目录第五章层析技术生物化学与分子生物学教研室徐宏伟目录层析法也称色谱法(chromatography)，是1906年俄国植物学家MichaelTswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”。1941年，英国生物学家Martin和Synge首先提出了色谱塔板理论，为后来各种色谱技术的发展奠定了基础。目录层析法最基本的特征是有一个固定相和一个流动相，当两相作相对运动时，由于混合物中各组分在物理化学性质(如吸附力、溶解度、分子的形状与大小、分子的电荷性及亲和力等)上的差别，使各组分在两相间进行反复多次的分配而得到分离。目录目录层析类别主要依据的理化性质此类的层析方法举例吸附层析吸附力磷酸钙凝胶层析分配层析分配系数各种薄层层析、纸上层析离子交换层析分子的电荷性、极性DEAE-纤维素柱层析凝胶过滤层析分子大小交联葡聚糖柱层析亲和层析亲和分子间的亲和力目录层析技术可按两相的状态不同进行分类，如以气体为流动相的叫做气相层析（gaschromatography），以液体为流动相的叫做液相层析（liquidchromatography）。由于固定相也有液体和固体的不同，故气相层析还可细分为气—液和气—固层析两种，同理，液相层析即可细分为液—液和液—固层析两种。目录根据流动相的形式：液相层析、气相层析目录层析基本操作过程装置选择上样和洗脱结果检测上样均一性洗脱装置目的不同检测方法不同活性检测基质均匀性柱层析的L/d比值目录4、层析装置的仪器化HPLC与微机、质谱等连用目录层析前蛋白质处理主要是利用盐析法、等电点沉淀、有机溶剂沉淀等方法，使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白分开，这些方法的特点是简便、处理量大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质，但分辨率低。目录第一节凝胶过滤层析技术又称凝胶排阻层析或分子筛方法利用某些化学惰性的多孔网状结构的物质(多为凝胶)为填料，使混合物中的各种物质按其分子大小不同得到分离。目录优点：凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，温度范围广，不需要有机溶剂，分离效果好缺点：样品被不断稀释，上样量不能太大，否则分辨率变差目录一、凝胶过滤层析的基本原理多孔性亲水性凝胶一是随洗脱液垂直向下移动二是无定向的扩散运动。凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。目录凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，小分子可以进入凝胶网孔，而大分子则排阻于颗粒之外。目录大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出层析柱目录目录目录目录目录分配系数(kd)Ve为某一被分离成分被洗脱时所用洗脱液的体积，称为洗脱体积；Vo为凝胶颗粒间自由空间的总容积，称为空白体积或外水体积；Vi为凝胶颗粒内部孔穴的总容积，称为内水体积或进人体积。目录体积参数分子在柱中移动的速度取决于该分子在固定相和流动相间的分配系数Kd，Kd表示某一分子在特定的凝胶柱内的洗脱行为。Kd＝(Ve一Vo)／ViVe洗脱体积Vo外水体积Vi内水体积目录目录Ve=Vo该成分的分子全部被排阻在凝胶颗粒的间隙中，因而洗脱速度最快。即该成分的Kd＝0。Vi＝Ve-Vo该成分不被排阻而可完成进入凝胶颗粒内部,因而洗脱速度最慢。即该成分的Kd=l。Kd值介于0-l之间，物质的洗脱速度随其Kd值的增加而降低一般物质的Kd值是0Kdl。洗脱行为可以有三种可能的情况:目录凝胶Kd＝0Kd=l0Kdl目录目录Kd具有以下意义：（1）对于完全被排阻的极端大分子，由于Ve＝Vo，因此Kd＝O（2）对于能自由扩散凝胶颗粒内部的小分子物质，Ve＝Vo＋Vi，Kd＝1（3）对于能部分扩散入凝胶颗粒内部的大分子物质，Kd在0～1之间（4）凡Kd＞1的物质，表明它们能被凝胶吸附或具有离子交换作用，而不仅仅是分子筛效应（5）Kd值越接近1，表明分子越小，洗脱越慢；相反，Kd值越接近0，表明分子越大，洗脱越快。目录柱床体积(Vt)为凝胶基架的总体积(Vr)与内水体积(Vi)及外水体积(Vo)之和。实验室常用Vt－Vo代替Vi来计算分配系数，所得值称为平均分配系数，用Kav表示，其定义为对于某一特定的凝胶柱，Kav与kd之比是1个常数，它不随溶质的性质或浓度而改变，因此可代替kd来度量被分离物的洗脱行为。目录影响分离效果的因素流速加样体积样品浓度离子强度目录二、常用凝胶的种类和性质立体多孔网状结构，惰性对pH和温度的稳定性能反复使用颗粒大小比较均匀葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶及琼脂糖凝胶。目录凝胶过滤层析的介质葡聚糖系列琼脂糖系列聚丙烯酰胺系列多孔硅胶目录基本操作凝胶的选择凝胶柱的制备上样洗脱凝胶柱的重复使用与保存目录三、凝胶过滤层析的实验技术(一)凝胶的选择与处理根据被分离物质分子的大小、形状和分离目的进行选择1.分离分子量相差悬殊的两种物质，如蛋白质脱盐2.纯化蛋白质时，则需要根据各组分的分子量分布范围及各种凝胶的分离范围选用合适的凝胶目录粗粒，中粒：分离效果差，但流速快，可用于工业上物质的制备细粒：洗脱曲线峰形对称、峡窄、分离度好超细颗粒：能给予最好分离，但流速慢，实验时间长目录(二)层析柱的选择柱子要直，内径均一；下端死区小柱的有效长度越大，洗脱峰之间的距离则越宽，分辨率越高。过细的柱子，会因管壁效应而影响分离效果目录柱层析的L/d比值目录2、凝胶柱的制备用于分组分离短而粗L/D值＜10用于分级分离L/D值比较大对很难分离的组分一般需要100cm左右长的层析柱，其直径在1～5cm范围内，小于1cm产生管壁效应，大于5cm则稀释现象严重。柱L/D值的选择目录装柱前，凝胶基质用蒸馏水或洗脱液中充分溶胀。凝胶柱填装后通常可以采用一种有色的物质，如蓝色葡聚糖-2000、血红蛋白等上柱，以检测凝胶柱的均匀程度。目录(三)洗脱剂的选择能完全溶解欲分离的样品而且对样品的稳定无影响；且不影响对样品的监测，并能很快去除。洗脱剂的离子强度至少0.2mol/L目录(四)装柱层析柱垂直，气泡排除，一次倾入层析柱洗脱平衡凝胶柱应均匀、无断层、无气泡(五)上样样品应预先离心，均匀地加样目录(六)洗脱注意控制流速降低流速通常能提高分辨率流速过慢，则纵向扩散和对流反会限制分辨率的提高流出液用人工或自动部分收集器定量地分部收集(七)保存加防腐剂或灭菌后，可置冰箱中保存数月目录四、凝胶过滤层析的应用1、主要用于大分子物质：如蛋白质、核酸、多糖等的分离2、脱盐，放射性同位素，荧光素3、蛋白质的分子量的测定离心柱层析法：分子克隆目录3、测定高分子物质的分子量测大于所用载体上限分子的洗脱体积测小于下限的分子的洗脱体积标定凝胶过滤柱的Vo标定凝胶过滤柱的Vi测定一系列已知分子量的标淮样品在柱上的洗脱体积Ve以(Ve-Vi)／(Vo-Vi)和1ogMw作图测得了待测分子量的样品的Ve由(Ve-Vi)／(Vo-Vi)从标准曲线上可以求得未知样品的分子量蓝色葡聚糖氨基酸、有色盐类↓↓↓↓↓以标准样品的分子量的1ogMw对Ve作图or目录洗脱液中蛋白质浓度目录目录4、高分子溶液的浓缩将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外离心或过滤，去除溶胀的凝胶浓缩的高分子溶液↓目录5、蛋白质复性研究变性蛋白加入凝胶柱高浓度变性剂存在，蛋白呈无规则卷曲变性蛋白体积大，只能进入颗粒间隙，迁移速度快变性剂分子量小，进入颗粒内部，迁移速度慢缓冲液洗脱蛋白变性剂浓度降低，转成复性缓冲液变性蛋白复性，以天然形态洗脱出柱↓↓目录五、注意事项(一)柱床支持物使用不当(二)凝胶膨胀过程中操作不当(三)凝胶柱、毛细管和流出口处有气泡(四)工作压过高(五)层析柱的保洁差目录第二节离子交换层析技术离子交换层析(ion-exchangechromatography)是根据物质所带电荷的差别进行分离纯化的一种方法目录一、离子交换层析的基本原理目录离子交换剂是以纤维素或葡聚糖凝胶等不溶性物质为母体引入阳性或阴性离子基团的特殊制剂带有阳离子基团的交换剂，可置换吸附带负电荷的物质，称为阴离子交换剂带阴离子基团的交换剂，则可置换吸附带正电荷的物质，称为阳离子交换剂目录蛋白质分子是两性物质不同的蛋白质有不同的等电点，与不同类型离子交换剂以不同的亲和力相互交换吸附。当缓冲液中的离子基团与结合在交换剂上的蛋白质相竞争时亲和力小的蛋白质分子首先被解吸而洗脱亲和力大的蛋白质则后被解吸与洗脱因此，依靠增加缓冲液的离子强度和/或改变酸碱度，可改变蛋白质的吸附状况，使不同亲和力的蛋白质得以分离。目录目录目录目录离子交换剂的基质琼脂糖离子交换剂离子交换交联葡聚糖聚苯乙烯离子交换纤维素目录二、常用离子交换剂的种类及其性质1、离子交换纤维素树脂以纤维素为母体，结合一定的离子基团而成。离子交换纤维素上的交换基团排列疏散，对蛋白质等大分子的吸附不太牢固，用温和的条件便可将其洗脱下来，因此不会引起大分子变性，是分离蛋白质、核酸、抗生素等不太稳定的生化物质的理想介质。目录常用：DEAE-纤维素（二乙基氨基纤维素）CM-纤维素（羧甲基纤维素）开放性长链和松散的网状结构，有较大的表面积，大分子可自由通过，使它的实际交换容量要比离子交换树脂大的多。亲水性，对蛋白质等生物大分子物质吸附的不太牢，用较温和的洗脱条件就可达到分离的目的，因此不致引起生物大分子物质的变性和失活。回收率高优点：目录2、离子交换葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶为母体，结合一定的离子基团而成交换容量大，一般为离子交换纤维素的3-5倍由于其是网状结构，因而其不仅具有离子交换能力，还同时兼有分子筛的作用。目录基本操作缓冲液的选择层析柱的选择洗脱流速↓加样洗脱洗脱液的监测收集及组分鉴定离子交换剂的清洗、再生和保存↓↓↓←离子交换剂的处理↑离子交换剂的选择目录三、离子交换层析的实验技术（一）离子交换剂的选择与处理有阴阳离子之分外，还有强弱之分应根据被分离物质的物理化学性质，即根据其所带电荷的种类、数量及所处的环境，尤其是环境中是否有其它离子，这些离子的电性、数量等因素进行选择。目录对吸附性强的离子或不稳定的物质，常选用弱酸性或弱碱性离子交换树脂，这样易于洗脱和再生，也不易破坏被分离物质对于吸附性弱的离子，常选用强酸性或强碱性离子交换树脂，这样可利用碱性或酸性条件增强被吸附物的离子化作用。目录分离蛋白质时若在高于其等电点的pH条件下不发生变性，则可选用阴离子交换剂；若在低于其等电点的pH条件下，不发生变性，则可选用阳离子交换剂；如果某蛋白质在高于或低于其等电点1个pH单位的条件下都很稳定，则选用两种离子交换剂中的任何一种均可达到分离目的。目录目录2、离子交换剂的处理酸碱浸泡进一步去除杂质，并使离子交换剂带上需要的平衡离子，一般阳离子交换剂最后用碱NaOH处理，阴离子交换剂最后用酸HCl处理。膨化将干粉在水中充分溶胀，以使离子交换剂颗粒的孔隙增大，具有交换活性的配基充分暴露出来。水悬浮去除杂质和细小颗粒目录(二)装柱一般以直径与长度之比为1：15为宜当样品量多且组分复杂时，可选用稍长的柱子用起始缓冲液充分滴注洗脱，至流出液与进柱前溶液有相同的pH应注意离子交换树脂在柱中均匀分布(三)加样加样前，样品应预先对起始缓冲液充分透析平衡目录(四)洗脱①增加缓冲液离子