共聚焦课件

激光扫描共聚焦显微技术Laserscanningconfocalmicroscopy主讲教师：林叶副教授实验目的1.了解激光扫描共聚焦显微镜的硬件组成；2.了解激光扫描共聚焦显微镜的基本操作；3.了解激光扫描共聚焦显微镜在生命科学领域的应用。什么是激光扫描共聚焦显微镜？以激光作为激发光源，采用光源针孔与检测针孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统。激光扫描共聚焦显微镜的硬件组成光学显微镜激光光源扫描模块（共聚焦光路通道针孔、扫描镜）光检测器计算机系统（数据采集、处理、转换）图形输出设备NikonA1R激光扫描共聚焦显微镜ZeissLSM510激光扫描共聚焦显微镜LeicaTCSSP2激光扫描共聚焦显微镜激光光源及控制装置共聚焦扫描和检测装置防震台显微镜激光扫描共聚焦显微镜1.激光作为光源；2.具有多个荧光通道，可同时探测多个被标记物；3.具有光源针孔和检测针孔，光源针孔和检测针孔共轭（共焦），共焦点即被探测点，被探测点所在的平面为共焦平面；4.逐点扫描成像。激光扫描共聚焦显微镜的设计特点激光器——多谱线激光光源UV激光器：351nm364nm半导体激光器：405nm氩离子激光器：457nm477nm488nm514nm氦氖绿激光器：543nm氦氖红激光器：633nm逐点扫描成像ZOOMIN激光共聚焦显微技术在生命科学研究中的应用一拍摄多重荧光影像通过一种或多种荧光探针标记后，可对固定的组织或活体样本进行亚细胞水平的结构功能研究。蛋白质的表达定位细胞器定位研究奶牛乳腺上皮细胞角蛋白18表达细胞核PI标记（red）角蛋白18FITC标记（green）妊娠3个月奶山羊乳腺上皮细胞主要细胞器的变化ER.内质网；M.线粒体；N.核奶山羊乳腺上皮细胞中的细胞器通过序列光切功能，可获得标本真正意义上的三维数据，经计算机图像处理及三维重建软件，产生生动逼真的三维效果，可进行形态学观察，并揭示亚细胞结构的空间关系。二、三维立体影像重建Z轴光切细胞内离子探针钠离子探针：SBFI钾离子探针：PBFL-2镁离子探针：mag-fura-2钙离子探针：Fluo-3三、细胞内物质动态观察及定量分析Ca2+成像，时间序列（Fluo3-AM）胞浆细胞核植物细胞中过氧化氢的含量随着盐胁迫时间进程的变化（图片时间间隔5min）植物细胞膜点位去极化随盐胁迫时间进程的变化（红色荧光深度代表去极化程度）四.荧光漂白恢复生物膜脂质分子的侧向扩散检测细胞连接间的信息传递胞浆及细胞器内小分子物质转移的观测荧光漂白卵细胞局部荧光漂白五、荧光共振能量转移用于研究蛋白质-蛋白质之间的相互作用荧光共振能量转移的条件：两个荧光分子：供体-FL1，受体-FL2供体与受体的距离在2-7nm，随着距离延长,FRET呈显著减弱.供体的发射波长与受体的激发波长一致实验结果奶牛乳腺上皮细胞角蛋白18免疫荧光检测细胞爬片，冷甲醇固定20min，采用PI进行核染色，FITC-角蛋白18免疫荧光染色。Zoomin