CHIP(1)

染色质免疫沉淀及其测序王雅琪目录简介技术原理技术流程应用优缺点测序一、简介ChIP是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达关系。二、原理染色质免疫沉淀技术（chromatinimmunoprecipitationassay,ChIP）的基本原理是在活细胞状态下把细胞内的蛋白质和DNA交联，超声波将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后用所研究的目的蛋白质特异性抗体免疫沉淀蛋白质-DNA复合体，从而特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段。技术示意图三、技术流程具体操作流程1、甲醛交联细胞具体步骤2、染色质超声断裂1.加SDS裂解溶液重悬浮沉淀，冰上10min。每1min颠倒摇动一次离心管。2.把DNA粉碎为长度200-1000bp，置于冰上。(不同样本都进行超声条件优化实验)3.14000rpm离心10min(4℃)，转移上清于1.5ml离心管。3、免疫沉淀蛋白和DNA复合物4、收获免疫复合物（抗体-蛋白质-DNA）5、洗脱免疫复合物6、去除甲醛交联解交联：加入20ul5MNaCl（NaCl终浓度为0.2M).混匀,65℃,解交联过夜。7、DNA纯化1、酚-氯仿抽提2、硅胶柱纯化8、染色质免疫共沉淀DNA的分析和蛋白质在DNA上结合位点的鉴定1.如果目的蛋白靶序列已知，或怀疑某一序列是目的的蛋白靶序列，则可选用定量或者半定量PCR方法。2.如果目的蛋白的靶序列未知或者研究目的蛋白基因组分布情况，找出转录因子结合位点，则可采用ChIP克隆测序，ChIP-chip，和ChIP-seq方法四、应用1.组蛋白修饰研究2.转录调控分析3.药物开发研究4.有丝分裂研究5.DNA损伤与凋亡分析五、优缺点优点：充分反映生理条件下DNA与蛋白质相互作用的真实情况，可以找出生理条件下某个DNA结合蛋白与DNA序列的结合位点，从而反映体内基因表达调控的真实情况。缺点：需要一个特异性蛋白质抗体，有时难以获得；为了获得高等丰度的结合片段，必须实验演示胞内条件下靶标蛋白质的表达情况；调控蛋白质的基因获取可能需要限制在组织来源。注意事项1、抗体与目的蛋白结合的有效性和特异性ChIP所选择的目的蛋白的抗体是ChIP实验成功的关键。因为在蛋白质与染色质交联结合时，抗体的抗原表位可能因为与结合位点的距离太近，不能被抗体识别，所以不能有效地在体内形成免疫沉淀复合物，直接影响ChIP的结果。所以不是所有的抗体都能做ChIP实验的，只有经过ChIP实验验证后的抗体才能确保实验结果的可靠性。如果目的蛋白没有商品化的适用于染色质免疫沉淀实验的抗体，只有其他用途的抗体时，可以先做蛋白质免疫沉淀检测。如果抗体可以成功的沉淀蛋白，再进行染色质免疫沉淀实验的检测。2、交联的条件交联所用的甲醛终浓度约为1%，而交联时间需要预实验来确定。通常的交联条件为室温10min。甲醛的交联反应可被加入的甘氨酸终止。交联时间如果过长，细胞染色质难以用超声波破碎，影响ChIP结果，而且实验材料也容易在离心过程中丢失。交联时间如果过短，则交联不完全，产生假阴性。3、超声片段的大小打断后的染色质片段的长度应主要集中在200-1000bp左右。六、测序ChIP-Seq的原理是：首先通过染色质免疫共沉淀技术（ChIP）特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，并对其进行纯化与文库构建；然后对富集得到的DNA片段进行高通量测序。研究人员通过将获得的数百万条序列标签精确定位到基因组上，从而获得全基因组范围内与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段信息。应用领域（1）判断DNA链的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰；（2）检测RNApolymeraseII及其它反式因子在基因组上结合位点的精确定位；（3）研究组蛋白共价修饰与基因表达的关系；