微生物遗传与分子生物学思考题

第五章1.16SrRNA的功能机制是什么？举例说明16SrRNA序列分析在现代微生物学领域有哪些应用（1）16S核糖体RNA（16SribosomalRNA），简称16SrRNA,是原核生物的核糖体中30S亚基的组成部分。（2）16SrRNA具有与原核生物核糖体大亚基中的23SrRNA相似的结构决定功能，可作为核糖体蛋白质结合的架构；16SrRNA的3'端含有能与mRNA上游AUG起始密码子通过氢键结合的反夏因-达尔加诺序列；16SrRNA能通过氢键与23SrRNA结合，增强原核生物70S核糖体一大一小两个亚基（50S亚基与30S亚基）结合时的稳定性；16SrRNA能通过其1,492及1,493的腺嘌呤残基的N1原子与mRNA骨架上的2'OH基团之间产生氢键，使核糖体A位密码子－反密码子的碱基互补配对稳定化；在众多的生物大分子中，最适合于提示各类生物亲缘关系的是rRNA,尤其是16SrRNA被普遍认为是一把好的谱系的“分子尺”这是因为：1.rRNA参与生物蛋白质的合成过程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物进化的漫长经历中其可能保持不变。2.在16SrRNA分子中，既含有高度保守的序列区域又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物。3.16SrRNA相对分子质量大小适中，便于分析。在5SrRNA、23SrRNA和16SrRNA三种分子中，5SrRNA包含120个核苷酸，虽然它也可以作为一种信息分子加以利用，但由于其信息量小应用上受到限制。23SrRNA蕴含着大量的信息，但序列测量和分析比较的工作量较大。而16SrRNA相对分子质量大小适中（约含1540个核苷酸）含有比较广泛的的生物信息量，加上rRNA在细胞中含量大（约占细胞中RNA的90%）也易于提取。4.16SrRNA普遍存着于真核生物和原核生物中，真核生物中其同源分子是18SrRNA。（3）细菌分类16SrRNA基因序列分析法鉴定常见的病原细菌：朱飞舟等人利用16SrRNA基因序列分析法鉴定了14种临床上常见的细菌，且该方法较生化分析法更加稳定，重复性更好，16SrRNA基因序列分析法可以作为临床鉴定病原细菌的一种更有效方法。鉴别难于区别的细菌，在细菌鉴定中,16SrRNA基因序列分析技术能够精确到种的水平,可以用来鉴定用其他方法难于区别的细菌，众所周知,草绿色链球菌能够导致心内膜炎,但该菌包括了变异链球菌、血链球菌、唾液链球菌、轻型链球菌和米勒链球,它们的致病能力差别很大,因此如果能够早期鉴定血液中分离细菌的种类,对临床诊断和预测病情均有重要的作用。然而,这5种链球菌通过表型分析难于区分,采用16SrRNA基因序列分析,就能快速地鉴定出标本中的细菌种类。鉴定分枝杆菌分枝杆菌分为人类病原菌、动物寄生致病菌和腐物寄生菌3大类,形态、结构类似,种类繁多,区分起来有一定的困难;同时致病分枝杆菌大多生长缓慢、培养时间长,有的甚至不能培养。因此,16SrRNA基因序列分析技术很快被应用于临床分枝杆菌的鉴定。④鉴定微环境中存在的多种细菌。在实际生活中,很多条件下存在的细菌都由复杂群体组成。医学临床取样标本,比如口腔菌群或者体内插管形成的生物膜上往往有多种细菌混合生长,其中包括一些目前还无法培养的细菌,因此很难全面了解特定环境中细菌的种类和作用。近年来,人们采用不依赖细菌培养的方法,对生长在特定微环境的细菌进行研究,取得了一定突破。⑤我们可以根据16SrRNA序列比较推测细菌间的进化关系,研究某一特定环境中微生物的区系组成，进而了解其种群动态，研究微生物的多样性。陈泽祥等选取3株不同血清型的鸭疫里氏杆菌广西分离株GXRA01、GXRA07和GXRA09进行16SrRNA基因序列分析，基于其同源性，表明这3株菌株应为鸭疫里氏杆菌。2.哪些分子生物学特性使极端嗜热古菌成为地球上最耐热的生命形式？（1）基因组：高G+C(60-70%),结构更稳定，特殊形式的DNA拓扑异构酶，DNA反解旋酶，促进DNA分子形成正向超螺旋，增强DNA分子的热稳定性；多复制子及多复制起始位点，基因组复制稳定性，每个复制子多拷贝，生理调节及抗损伤的适应性；细胞内特殊因子如多胺类物质可以促进嗜热菌蛋白质与核酸的合成能力，提高核酸的稳定性，并对某些酶具有激活作用。（2）蛋白组：典型的呈酸性的蛋白组，蛋白表面富含酸性氨基酸，可以帮助蛋白周围形成水化层，增加其可溶性、减少其聚集盐析的可能，在高K+条件下行使正常功能；蛋白亚基之间的相互作用和多聚化，离子对、疏水相互作用以及盐桥也可起到稳定蛋白的作用。（3）细胞膜：稳定的醚键结构，细胞膜中不饱和脂肪酸含量降低，饱和脂肪酸的含量增加，提高细胞膜的抗热能力。（4）特殊代谢途径，通过快速合成或替换热稳定性较差的代谢产物（或辅酶）来提高酶分子的催化效率以及一些特殊的保护机制（如微环境等）来维持其在高温条件下的正常代谢活动。3嗜碱微生物通常也嗜盐，试分析可能的原因在嗜碱微生物中，主动离子运输机制是PH值稳态机制的中心，而pH稳态机制限制了生长的pH值的上限。有大量的证据表明，嗜碱菌在碱性pH下生长时，胞质酸化的获得是与Na+/H+有关，对于嗜碱菌和pH稳态缺乏的非嗜碱突变株的对比研究表明Na+/H+泵是胞质酸化的关键。许多非嗜碱性的突变株都缺乏胞质pH的能力。也缺乏Na+/H+泵活性，Na+/H+泵催化胞质内的Na+排出，同时外部环境中的H+进入胞质内。在这个过程中胞质能被酸化，为了支持pH稳态的连续性，必须有Na+的重新进入作为Na+/H+泵的底物，而Na+的主要来源是NACl，因此嗜碱细菌通常也嗜盐。4通过文献阅读，了解古菌复制过程中不同阶段是如何偶联的（文献）（1）复制的起始；复制起始蛋白识别复制原点,复制原点处DNA双螺旋的解开及其它蛋白与OBP(原点结合蛋白)一DNA复合物相互作用,参与解旋酶的装配;2)复制的延伸:解开的DNA单链的稳定,引物合成,DNA链延伸;3)冈崎片段的成熟及复制的终止:包括去除RNA引物,填充缺口,滞后链上冈崎片段的连接复制由起始步骤控制,一旦复制开始,它就会继续下去,直到整个基因组都被复制同时,DNA复制又是一个由多种酶参与的代谢过程,由30种以上的酶和蛋白质协同合作（2）复制起始在古菌中发现了许多与真核生物Orcl和Cdc6同源的Cdc6蛋白家族,该类蛋白具有原点识别、结合和MCM征募的三重功能，古菌的Orcl/Cdc6蛋白和细菌的DnaA、真核生物ORC的3个亚基(Orel、4和5)以及真核生物Cdc6蛋白一样都属于AAA+ATPase超家族的一员。除了3个Methanogeni古菌外,目前所有基因组测序的古菌包含1一9个Orcl/Cdc6蛋白，嗜热古菌S.solfataricus染色体中鉴定了三个DNA复制原点和对应的三个Orcl/Cdc6同源蛋白:SsoCdc6一l,SsoCde6一2,SsoCde6一3这三个Orcl/Cdc6同源蛋白表现出不同的原点DNA结合活性,这表明它们在复制叉上行使不同的功能,同时它们有可能在延伸过程中也发挥一定的作用。（3）DNA复制的延伸DNA双链打开后,单链结合蛋白SSB很快和暴露的DNA单链结合,从而避免DNA复制期间单链DNA被化学修饰或被核酸酶降解,防止单链DNA重新配对形成双链DNA,起到保护单链的作用所有的SSB都是通过一个共同的寡核营酸/寡聚糖折叠与DNA结合，DNA聚合酶需要DNA引物酶在模板DNA上合成短的RNA引物后才能合成DNA,真核生物引物酶是四亚基的复合物引物酶活性需要p48和p58两个亚基,其中P48是催化亚基。古菌基因组编码P48和P58的同源蛋白，似乎古菌的双亚基引物酶组合了真核生物四亚基复合物的功能,但是引物酶的保真性差。DNA复制是通过DNA聚合酶以ssDNA为模板合成互补链来完成的。古菌中含有B、D和Y型DNA聚合酶、，它们在亚基组成和催化特性(如持续性、保真性和链延伸速率等)等方面有区别,不同的聚合酶参与复制!修复和重组等过程。生物的DNA聚合酶本身的持续性都较差,需要与一个滑夹结构的环状蛋白复合体(pCNA)相互作用从而获得持续性。古菌基因组至少编码一个PCNA同源蛋白,在S.tokodaliistr.7中有3个PCNA同源蛋白。氨基酸序列、长度、电荷分布和三聚体的三级结构方面,古菌与真核生物的pCNA较为相似在DNA复制的时候,复制叉前后会分别产生正!负超螺旋,拓扑异构酶通过改变DNA连环数来调节DNA超螺旋水平。根据作用机理,拓扑异构酶可以分成I型和11型两大类,每种类型又可以分成许多小类，两大类拓扑异构酶在古菌里都存在,它们不但参与DNA代谢还起到了稳定DNA的作用。目5.tokodaiistr.7的拓扑异构酶己经得到了结构解析。（4）冈崎片段的成熟在DNA复制的过程中,先导链的复制是连续的,而后随链是不连续的,会产生一系列的冈崎片断,需要FlapEndonuclease、RNaseH和DNA连接酶的协同作用,将这些片断连接起来才能产生成熟的双链DNA。Fen-1是DNA复制和修复中的重要蛋白,具有5.侧翼内切核酸酶活性和5.-3.外切核酸酶活性Fen一1的5.一3.外切核酸酶活性加上RNaseH的活性才能使冈崎片断成熟。古菌的Fen一1在氨基酸序列和生化特性方面都类似于真核生物。所有生物体内都有RNaseH,能够特异降解RNA一DNA杂交体中的RNA。RNaseH主要分为I型和11型两大类，古菌里只含有11型RNaseH,其结构和生化特性方面与细菌和真核生物的类似,因此,RNaseH的功能可能在所有生物中都很保守。5比较古菌和真核生物遗传的异同，了解古菌相关机制研究对基础医学研究的意义（文献）相同点：（1）复制过程有多个复制起点；都需要转率起始复合物；都会形成复制叉；转率过程中都会有单链结合蛋白，DNA聚合酶，引发酶等因子，古菌与真核细胞的复制基本相同。（2）转录过程6如果要人工合成1个单细胞生命的基因组，在基因组有效复制分配方面需要考虑哪些因素基因组复制是生命得以遗传与繁衍的关键，而复制起始及其调节则是这一生命过程的关键。保证与复制有关的酶系的完整，例如引物酶催化RNA引物的合成，起始复合物促进复制叉的形成、单链DNA结合蛋白维持DNA的单链状态，RNA引物的切除和缺口的填补，后随链上冈崎片段的连接，以及有效的终止子，为保证DNA扩增的保真性，其DNA聚合酶还应该有3’-5’外切酶活性等，真核细胞DNA复制过程较为复杂，可选择古菌或者细菌的复制机器，另外为了保证复制的效率可以在基因组中加入多个复制起始位点，有重组酶保证即使DNA在复制过程中即使发生重组也能分离成单个DNA分子；生物体遭受各种内外因素的损伤是无法避免的，因此还必须存在DNA的损伤修复机制；DNA复制完成后要平均分配到两个子代细胞中，可以利用细菌的par系统和古菌的seg系统，要保证有类似着丝粒的DNA结构存在，保证与分配有关的蛋白质与DNA的特异性结合，有调控细胞分裂的基因并且保证分裂完成后分配系统能与基因组解离。7查阅文献，详细描述一种古菌的遗传转化方法，理解各个步骤的意义和注意事项（课件14嗜盐古菌遗传转化方法）8如何设计基因敲除等相关实验分别证明一个基因是非必需的，是重要的，或者是必不可少的证明一个基因是非必需还是重要的还是必不可少的，首先就要构建一个敲除载体，先把该目的基因敲除。就是说，现扩增出目的基因的上下游同源臂，构建出一个质粒敲除载体，然后将质粒载体导入到野生型细胞中，诱导其发生同源重组，进行一次交换，随后进行双交换，从而成功的敲除目的基因，获得突变株。若该基因敲除后，单独敲除该目标基因的突变株仍然能够合成该物质，那么可以说明，该基因编码的物质可以由多种途径合成或者有编码该产物的同源基因，说明该基因是非必需的，否则该基因可能是重要的或者必不可少的。若敲除该基因后，其编码物质不能合成，并且严重影响到突变株的生命活动以及代谢，那么该基因是必不可少的。但是若突变株只是该基因编码的物质减少，但不会过多影响其代谢及生命活动，那么可以说该