现代分子诊断技术2

利用核酸双链的碱基互补、变性和复性的原理，可以用已知碱基序列的单链核酸片段作为探针，与待测样本中的单链核酸互补配对，以判断有无互补的同源核酸序列的存在核酸探针是指带有标记的某一特定DNA或RNA片断，能与待测样本中单链核酸分子互补配对结合，进而检测同源序列探针标记物有放射性核素或非放射性核素（生物素、地高辛、荧光素等）两大类•分离杂交探针的方法：1.提取某一病原微生物株系的染色体DNA2.限制性内切酶进行酶解3.得到的酶解片段克隆进一质粒载体，构建质粒文库4.文库中重组质粒的插入片段即可用来分别同病原性微生物和非病原性微生物的核DNA进行杂交、筛选•核酸杂交的灵敏度和可靠性极高•用探针直接同粪便样品、尿样、血样、喉洗液和组织样品中的目标DNA进行杂交，且无需预先纯化DNA•若样品中的目标分子非常少，则需通过PCR将目的序列扩增，再进行杂交检测从理论上讲，用DNA杂交来诊断疾病可用于对所有的致病微生物的检测4、非同位素标记探针•32P的缺点：⑴半衰期短，仅13天⑵操作起来比较危险⑶必须要有特殊的实验室设备进行操作⑷放射性垃圾的处理繁琐•非放射性杂交检测系统：通过酶促反应将某种底物转变成生色物质或化学发光物质而达到放大信号的目的•采用将生物素（biotin）标记的核苷酸掺入DNA的方法制备探针•生物素标记的DNA在室温下至少可保存一年•检测发光和颜色变化可在几小时内完成BBBBAPBBAP生物素加入链霉素抗生物蛋白加入生物素标记的碱性磷酸酶探针目的DNA加入不同的生色或化学发光底物荧光标记的引物直接进行PCR检测DNA引物1引物2荧光染料PCR层析荧光检测游离引物•分子夹心探针检测发出荧光分子夹心探针(没有荧光)荧光团猝灭剂目的DNA与目的DNA杂交TaqMan探针技术•原理：利用Taq酶的3′5′外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号，由于探针与模板特异性结合，荧光的强弱就代表了模板的数量3′5′5′3′QR上游引物下游引物5′3′3′5′QRTaqMan探针的荧光信号产生机制疟疾的分子诊断：•检测是否存在疟原虫1.抽取血样进行镜检2.免疫诊断:ELISA检测疟原虫蛋白或抗体无法区分是以前感染还是现在感染3.DNA杂交诊断例一：•DNA的杂交探针是一段疟原虫的高度重复的DNA序列•具体的分离过程：1.构建一个疟原虫的核基因文库2.用标记的疟原虫核DNA作探针去筛选核基因文库3.选出那些杂交信号最强的克隆4.用这些选出来的片段作探针，与疟原虫及其同属中不导致疟疾的种的核基因作杂交，以检查该片段作为DNA探针的可靠性锥虫的检测•锥虫在人体中可侵入肝、脾、淋巴结、中枢神经系统，在其中大量繁殖并杀死寄主细胞•显微镜检新鲜血液•取新鲜血液感染未携带锥虫的寄生虫,30-40天后杀死昆虫,镜检昆虫的肠道•免疫检测:假阳性高例二：•PCR检测•针对锥虫特有的一段188bp的DNA序列设计引物，特异地从锥虫基因组中扩增得到188bp的条带二、细菌性传染病及病毒性疾病的分子诊断技术•抗生素的不合理使用•DNA杂交•PCR检测•噬菌体介导DNA杂交•设计16SrRNA为探针•16SrRNA在细菌中拷贝数极高，高度的保守性•特异性不是很好•必须结合PCR技术PCR检测•nestedPCR•针对目的病原菌的不同保守区段设计多对引物每对引物都能特异的扩增出一段目的片段，病原菌存在的可能性大大增加模板使用外引物，进行第一次PCR扩增使用内引物，进行第二次PCR扩增第一次PCR扩增产物第二次PCR扩增产物巢式PCR原理示意图•PCR技术也会产生假阳性1.新扩增的目的DNA特异性不强2.退火温度过低3.模板中杂质的污染•假阴性1.存在Taq酶的抑制剂2.模板量过少3.模板DNA纯度不够•原位PCR(insituPCR,ISPCR)•在细胞或细胞切片上对待测的低拷贝数基因进行扩增，并通过原位杂交进行检测•不仅能检测出病原微生物的存在，且能够在组织细胞中定位原位杂交（nucleicacidhybridizationinsitu）将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，进而检测特异的DNA或RNA序列细胞原位杂交组织切片原位杂交DNA-DNARNA-DNA三类杂交RNA-RNA该法优点：不需提取核酸，故可完整保持组织或细胞的形态，因而更能准确地反映组织细胞的功能状态有噬菌体介导细菌检测•将荧光素酶基因引入到噬菌体的基因组，然后用转基因噬菌体去侵染待测样品•噬菌体侵染该宿主菌，大量合成包括荧光素酶在内的由噬菌体基因编码的蛋白，向体系中加入荧光素和ATP，就会有荧光产生•结核菌的检测•抗药性菌株的检测荧光素酶荧光素＋ATP荧光利用宿主细胞转录、翻译噬菌体基因荧光素酶基因宿主细菌噬菌体介导的细菌检测第三节DNA指纹每个人体细胞内都含有23对染色体，每条染色体中部含有一个DNA分子，DNA分子中的核苷酸序列包含着遗传信息，在DNA分子中存在三种类型：单拷贝序列、中等程度重复序列、高度重复序•每个重复序列在300个核苷酸长度之内，由于高度重复，序列经过超离心后以卫星带出现在主要DNA带的附近，所以也称卫星DNA，其中的重复序列单元则称为“小卫星DNA”•“小卫星”具有高度的可变性，但在“小卫星DNA“中有一小段序列则在所有个体中都一样，称为“核心序列”。如果把核心序列串联起来作为分子探针与不同个体的DNA进行分子杂交，就会出现各自特有的杂交图谱。它们与人的指纹一样具有专一性和特异性，因此称作“DNA指纹”•通过对人类基因组的解析，发现人与人之间99．99％的碱基序列都相同，而剩下的0.01%的碱基特征序列则来自于双亲，据此可用于“亲子鉴定”所罗门的审判：大家都听说过所罗门的审判这样一件故事：两位妇人都声称自己是孩子的母亲，于是所罗门就命令一名侍卫把那个孩子带来，要用剑将其辟成两半分给他们两，结果假母亲同意所罗门的判决，而孩子真正的母亲却恳求侍卫饶了孩子的性命，她解释说：“把孩子给了假母亲，总比让孩子惨死好。”当然，真假母亲也就水落石出了。滴骨验亲法：以生者的血滴在尸骨上，观察血能否浸入骨内，浸入的则被认为两者有血缘关系，在各种古籍中有多种记录。三国时代（公园220—280年）谢承著《会稽先贤传》中的《以弟血滴兄骨》可能是记录此法的最早的史料：陈业的哥哥因海难不幸殒命，当时一同遇难的有五六十人，并且尸体都已严重腐败而无法辨认死者的身份。陈业就用刀刺破自己的手臂将血分别滴在尸骨上，发现其血液只能浸入一具尸骨，其余皆不能。陈业就这样确认其兄的尸骨。合血法：等到了明代，更是采用了“合血法”来识别亲权。明末清初的检验书籍中都有相同的记载：“亲子兄弟或自幼分离，欲相认识。难辨真伪。命各刺出血，滴一器内，真则共凝为一，否则不凝也。”方法：•DNA指纹是指对待测样品中的DNA进行分析所得到的具有特征性的DNA分子杂交图谱•DNA酶解电泳转膜杂交•最常用的DNA探针是微卫星序列受害者血样犯罪嫌疑人衣物上血样犯罪嫌疑人血样