流式细胞学

流式细胞术流式细胞术概念流式细胞仪组成流式细胞图流式细胞术概念流式细胞术（FlowCytometry,简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特定群体加以分选研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物、及人工合成微球等研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量DNA含量检测与细胞周期的分析细胞凋亡细胞表面分子细胞内或细胞核内抗原其它流式细胞术的应用流式细胞术操作流程培养细胞血液骨髓新鲜组织石蜡包埋单细胞悬液制备荧光染色上机检测表型测定细胞分选流式细胞仪组成•液流系统：流动室，液流驱动系统•光学系统：激发光源，光束收集系统•电子系统：光电转换器，数据处理系统•细胞分选系统：喷嘴，电偏转板，样本收集器1.液流系统•鞘流技术：根据层流原理发展起来的技术，可以实现两种液体的同轴流动，样本细胞流位于轴心稳定流动，外面包裹有鞘液(sheath)。•流体动力学聚焦：稳定的液流从截面积较大的部分流入截面积较小的部分后，有一个聚焦收缩作用，细胞流直径被约束在10-20um，避免了多个细胞重叠进入检测区。流体动力学聚焦示意图激光照射点细胞流鞘液鞘液2.光学系统（一）前向散射光FSCFSC信号方向与激光束平行，偏离度一般在1-6度范围内，亦称小角度散射光，主要反映被测细胞的体积大小。•SSC方向与激光束和液流形成的平面相垂直，亦称90度散射光，其信号强度反映细胞内部颗粒度和表面凸起度。（二）侧向散射光SSC•实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。粒细胞单核细胞淋巴细胞红细胞、死细胞和碎片3.电子系统•光电检测器将光信号转换成电子信号。•前置放大电路将信号等比例放大，输出电脉冲信号。•模数转换器将模拟的电脉冲信号转换成数字信号。•数据处理系统计算机系统数据采集、分析。PMT前向散射光光电二极管4.流式分选lasers断裂点(充电)高压偏转板电荷式分选–超声振动器(15-100kHz)–液流充电系统–高压偏转板–收集装置(流式管、培养板)液滴延迟•在含有分选细胞的液滴上准确加电是有效分选的关键，但是细胞经过检测区(激光照射点)到加电位置(断裂点)有一个时间差，这称为液滴延迟(dropdelay)。•延迟时间直接影响着分选纯度，准确测定延迟时间是一个重要步骤。激光断裂点液滴延迟照射点流式细胞图•单参数直方图(Histogram)•双参数数据显示：–散点图(DotPlot)–伪彩图(Pseudo-colorPlot)–等高线图(ContourPlot)–密度图(DensityPlot)–假三维图(Pseudo3DPlot)•三维图(3DPlot)直方图Histogram•细胞的某一单参数数据的统计分布图，横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度的值，单位是道数，纵坐标一般是细胞数。Event#FL1FITC11027003720415……0…………10…………100…………1000CountsFITC荧光强度散点图•散点图中每个点代表一个细胞，X轴与Y轴分别代表一种参数，优点是比直方图直观。FL1FL2等高图和密度图•等高图：类似于地图中的等高线，同一条线上的细胞数目相等，越在里面的曲线代表细胞数目越多。•密度图：点密度越大的地方细胞越多，点密度越小的地方细胞少。假三维图和三维图CountsSSC→流式细胞图设门设门与数据分析•门(Gate，简写G)是流式细胞术中的一个重要术语，数据分析过程实际上就是选门和设门的过程。•R(Region，区域)。门可以是单一区域(G=R1)，也可以是几个区域组合在一起：G=R1andR2;G=R1orR2;G=R1notR2。线性门十字门同型对照：使用与实验抗体同种属来源，相同剂量及同种免疫球蛋白的相同亚型的抗体作为对照，用于检测和消除一抗抗体非特异性结合到组织细胞而产生的背景染色。设门注意：排除细胞碎片应用合适荧光阴性对照排除死细胞使用共享marker设置必须的荧光分析图强大的软件谢谢观赏！