时间分辨荧光免疫分析法乙型肝炎血清标志物分析灵敏度的建立与分

时间分辨荧光免疫分析法乙型肝炎血清标志物分析灵敏度的建立与分析EstablishmentandanalysisofanalyticsensitivityofhepatitisBvirusserummarkersbyTime-resolvedFluoroimmunoassay谭玉华陈鲜美卢顺舵沈健（广州市丰华生物工程有限公司，广东广州510730）摘要对乙型肝炎表面抗原和表面抗体定量测定试剂盒（时间分辨荧光免疫分析法）的分析灵敏度进行建立与分析，以便更好的指导临床诊断和进行流行病学研究。通过实验研究，乙型肝炎病毒表面抗原定量检测试剂盒和表面抗体定量检测试剂盒的检测低限分别为0.0356ng/mL和0.548mIU/mL，生物检测限分别为0.200ng/mL和5.00mIU/mL，功能灵敏度分别为0.200ng/mL和5.00mIU/mL，线性范围分别为0.200ng/mL-300ng/mL和5.00mIU/mL-1200mIU/mL，并达到中国药品生物制品检定所检定要求。时间分辨荧光免疫分析法乙型肝炎病毒定量检测试剂盒具有灵敏度高，线性范围宽，特异性强的特点，已能有效应用于临床体外诊断和流行病学研究。关键词时间分辨荧光免疫分析；乙型肝炎；标志物；分析灵敏EstablishmentandanalysisofanalyticsensitivityofhepatitisBvirusserummarkersbyTime-resolvedFluoroimmunoassayTANYu-hua,CHENXian-mei,LUShun-duo,etal.GuangzhouFenghuaBio-engineeringCo.,LTD,Guangzhou510730ChinaAbstractToestablishandanalysetheanalyticsensitivityforthequantificationkitsforhepatitisBvirus(HBV)surfaceantigen(HBsAg)andantibodytoHBsAg(anti-HBs),thekitsweremeasuredbyTime-resolvedFluoroimmunoassay(TRFIA),inordertothebetterinstructionclinicaldiagnosisandconductstheepidemiologyresearch.Throughthestudy,thelowerlimitofdetectionofthequantificationkitsforHBsAgandanti-HBsfor0.0356ng/mLand0.548mIU/mLrespectively,thebiologicallimitofdetectionis0.200ng/mLand5.00mIU/mLrespectively,thefunctionsensitivityis0.200ng/mLand5.00mIU/mLrespectively,thelinearscopeis0.200ng/mL-300ng/mLand5.00mIU/mL-1200mIU/mLrespectively,andpassedtheexaminationoftheNationalInstituteforControlofPharmaceuticalandBiologicalProducts.ThequantificationkitsforHBVserummarkersbyTRFIA,whichhasthehighsensitivity,thewidelinearscope,thegoodspecificity,couldhavetheeffecttouseintheclinicalinvitrodiagnosisandtheepidemiologyresearch.KeywordsTime-resolvedFluoroimmunoassay;HepatitisBvirus;Marker;Analyticsensitivity乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的检出是乙型肝炎病毒（HBV）感染的金标准。乙型肝炎病毒表面抗体（抗-HBs）是对HBV具有保护性的免疫指标，它的检出有助于乙型肝炎（简称：乙肝）的预防与接种。随着时间分辨荧光免疫分析法（TRFIA）在定量检测HBsAg和抗-HBs中的应用，对HBsAg和抗-HBs的分析灵敏度有了进一步提高，并且定量结果取代了定性报告，为临床诊断提供了更多的信息。在实验室，对试剂盒和方法学有必要建立自己的可定量报告的生物检测限或对试剂盒和方法学说明的检测限进行确认[1-2]，以便更好的指导临床的诊断。作者在此对乙型肝炎HBsAg和抗-HBs定量测定试剂盒（时间分辨荧光免疫分析法）的分析灵敏度进行了建立与分析。1材料与方法1.1材料与仪器高浓度HBsAg和抗-HBs血清各5.00mL，乙型肝炎病毒表面抗原定量检测试剂盒（国药准字S20050108）和表面抗体定量测定试剂盒（国药准字S20050110）（时间分辨荧光免疫分析法），以及DEM-III自动酶标洗板机和FWZ-I振荡仪均由广州市丰华生物工程有限公司提供。“检测HBsAg血清Panel国家参考品”（批准文号：[91]卫生参字0003）和“检测抗-HBs血清Panel国家参考品”（批准文号：[91]卫生参字0004）购于中国药品生物制品检定所。VICTOR2TMD1420MULTILABELCOUNTER（时间分辨荧光免疫检测仪）为Wallac产品。1.2方法采用试剂盒0标准品为空白液（BLANK），将高浓度HBsAg和抗-HBs血清加入空白液做系列稀释，组成0.000ng/mL、0.200ng/mL、0.500ng/mL、1.00ng/mL、2.00ng/mL和5.00ng/mL的HBsAg系列检测限品，以及0.000mIU/mL、5.00mIU/mL、10.0mIU/mL、20.0mIU/mL、30.0mIU/mL和40.0mIU/mL的抗-HBs系列检测限品。并将高浓度HBsAg和抗-HBs血清分别用空白液按一定比例稀释，各配得线性检测品。各用三批试剂测定“检测HBsAg血清Panel国家参考品”和“检测抗-HBs血清Panel国家参考品”，同时做标准曲线。HBsAg采用双抗体夹心法，抗-HBs采用双抗原夹心法，均按试剂盒说明书严格操作。空白样品做20次批内重复测定；对其它系列检测限品做天间重复测定，共连续做20天。实验均在VICTOR2TMD1420MULTILABELCOUNTER上测定荧光值（RF值）。收集数据，按文献[3]的方法分析TRFIA法HBsAg和抗-HBs定量检测试剂盒的检测低限（LLD）、生物检测限（BLD）、及功能灵敏度（FS），参考文献[4]及血清Panel国家参考品说明书对试剂盒进行检定。2结果2.1分析灵敏度空白样品做20次批内重复测定，其它系列检测限品做天间重复测定，共连续做20天。其系列检测限品的RF值检测结果详见表1。表1乙型肝炎表面抗原和表面抗体系列检测限品的荧光值检测结果HBsAg（ng/mL）0.0000.2000.5001.002.005.00抗-HBs（mIU/mL）0.0005.0010.020.030.040.0荧光值163333485631100121729141064168055568431156872114830837153334135513104671758139757143245737575148972147534700153135286122967617033380151513552498171990428048400681491356456829863173433816515486951871019352288423769113413244559310089178724346313876680897619765299423943813233342536612011190004275715076364939821100301733748013683390521697881565034988149148288203148842132730372142933445650100311365832543143848397078213272151131768156832695294922917106378541453598294732181830211388421694321757199495158733589815376397909620755294003521514863742611112882180234168315654691794620640304064036313603739749310442188264092616545336791920793304474029014643923635612242188784348917444877725515315250613528713794507657410561186404115112714348729613874265483028212813462673210951190454853012755138698017095246673468917683650624412122193364820612275522650117520243773475614233384554811514210544936212545801107532092732882388141377465451571221020808471271339589490222019232474406971499358151151332922010463881291524590031777526589389171418367361331258723149402691433521196221907629227409902.1.1检测低限HBsAg空白平均值BLANK均值）为1468.30，标准偏差（SD）为126.56，抗-HBs空白平均值为1451.95，标准偏差（SD）为147.49。这里采用99.7%的可能性来计算检测低限。按文献[1]的方法分析：LLDHBsAg=BLANK均值+3S0=1468.30+3×126.56=1847.98；LLD抗-HBs=1894.42。HBsAg若以空白RF值均值为检测的起点0,那么有99.7%的可能性,每次只做一个空白时,出现最高的空白RF值较该空白RF值均值高126.56的3倍,即379.68，这些RF值相当于样品具有的HBsAg，即为本方法HBsAg的检测低限。同理得，较该空白RF值均值高442.47这些RF值即为本方法抗-HBs的检测低限。将上面所有的RF值减去空白RF值均值，然后求每组的均值和标准差。见表2。表2乙型肝炎表面抗原和表面抗体检测系统分析灵敏度的计算HBsAg（ng/mL）0.2000.5001.002.005.00抗-HBs（mIU/mL）5.0010.020.030.040.0X2130.404394.159506.7516940.5540113.454035.906969.2517182.8525812.8035122.85SD384.94607.061266.492223.794683.79723.741088.422541.003826.133632.70CV（%）18.0713.8213.3213.1311.6817.9315.6214.7914.8210.34X-3×SD975.582572.975707.2810269.1726062.091864.663704.009559.861434.4124224.75379.68379.68379.68379.68379.68442.47442.47442.47442.47442.47现在0.200ng/mLHBsAg组减去空白后的RF值均值为2130.40，假定这段范围内H