TAKARA植物DNA提取试剂盒说明书

TaKaRaCode：D9194PlantDNAIsolationReagent（100量）次说明书宝生物工程(大连)有限公司目录内容页码●制品说明1●制品内容1●保存1●使用注意事项1●操作方法1●实验例2●Troubleshooting6●参考文献6●关联制品6●制品说明PlantDNAIsolationReagent是根据氯化苄法构建的，可以从植物材料中提取基因组DNA的Ready-to-use试剂盒。氯化苄具有能将含有纤维素等的细胞壁中的羟基苄基化，从而破坏细胞壁的特性。本制品利用了氯化苄的这一特性，将植物样品冻结融解后，再使用PipetTip的尖端将植物样品在Microtube壁上数次按压即可破坏细胞壁。本法与传统方法相比，省去了液氮研磨等烦琐步骤，有利于一次性处理大量样品。而且，本制品经过了改良，热处理时间只需15分钟，使用本制品从实验开始至水相回收只需30分钟时间。得到的基因组DNA可以进行PCR扩增及限制酶处理等。●制品内容（100次量）组份名称包装量ExtractionSolution140mlExtractionSolution28mlExtractionSolution3（100%BenzylChloride）15ml【试剂盒之外所需准备试剂及器具】◆异丙醇◆70%乙醇◆TEBuffer◆RNaseA（必要时使用）◆Micropipet◆Micropipet用Tip◆1.5mlMicrotube◆离心机（转速可达12,000rpm）◆桌面离心机◆桌面振荡仪●保存室温。ExtractionSolution2低温保存可能会有沉淀析出。如果发生析出现象，请于50℃溶解后，再于室温保存。●使用注意事项ExtractionSolution3中含有氯化苄，具有刺激性，使用时请注意。●操作方法1.将植物组织用剪刀剪至3mm以下角形状，重量在10～100mg范围内，装入1.5mlMicrotube中，于-20℃冻结。注：切断植物组织的剪刀要预先使用70％乙醇擦拭，特别要注意擦拭刀刃部位。2.取出冻结的植物组织于室温放置5分钟左右，使其融解。3.轻微离心，将植物组织收集在Microtube底部。4.使用PipetTip尖端将植物组织按压Microtube底部10次左右，进行物理破碎。5.加入400μl的ExtractionSolution1，剧烈振荡5秒钟。如果植物组织仍滞留于Microtube底部，需用手指轻弹Microtube使其悬浮。6.轻微离心，加入80μl的ExtractionSolution2，剧烈振荡5秒钟。添加ExtractionSolution2后产生白色沉淀，剧烈振荡后溶液呈白浊状态。如果植物组织仍滞留于Microtube底部，需用手指轻弹Microtube使其悬浮。7.轻微离心，加入150μl的ExtractionSolution3，剧烈振荡5秒钟。如果植物组织仍滞留于Microtube底部，需用手指轻弹Microtube使其悬浮。-1-实验操作流程简图8.轻微离心2秒钟以内，于50℃温浴15分钟。植物组织剪至3mm以下角形状，称重后于-20℃冻结（10～100mg植物组织/1.5mlMicrotube）冻结的植物组织室温放置5分钟左右融解轻微离心后、用PipetTip尖端将植物组织按压Microtube底部10次左右振荡仪振荡5秒，轻微离心加入ExtractionSolution150℃温浴15分钟上层水相移至新的Microtube中加入异丙醇混匀后，12,000rpm4℃离心10分钟除去上清，加入1ml70％乙醇清洗沉淀12,000rpm4℃离心3分钟除去上清，沉淀干燥后用TEBuffer溶解加入ExtractionSolution2振荡仪振荡5秒，轻微离心加入ExtractionSolution3振荡仪振荡5秒，轻微离心注：长时间离心ExtractionSolution3将会分层，务必控制在2秒钟以内。9.12,000rpm4℃离心15分钟。10.取上层水相移至新的1.5mlMicrotube中，上层水相约400μl。注意尽量不要混入水相以外的物质。11.添加等量的异丙醇，轻柔混匀。注：长时间存放可能会有夹杂物沉淀，尽量迅速进入下一步操作。12.12,000rpm4℃离心10分钟。13.弃上清，注意不要吸取沉淀。注：沉淀有时肉眼看不见。14.加入1ml70％乙醇，清洗沉淀。15.12,000rpm4℃离心3分钟。16.弃上清，注意不要吸取沉淀。17.沉淀干燥，加入适量TEBuffer（约20μl）溶解沉淀。注：沉淀过度干燥将导致难以溶解，请注意。注1.回收的基因组DNA溶液可直接作为PCR反应的模板或直接进行限制酶切断等反应。使用20μlTEBuffer溶解基因组DNA时，PCR反应液（25μl反应体系）或限制酶酶切反应液（20μl反应体系）中添加的DNA溶液在0.5～2μl之间为好。2.DNA溶液不立即使用时，请于4℃保存。●实验例实验例1：从植物组织中提取基因组DNA将拟南芥的幼芽、西红柿的幼芽和菠菜叶用剪刀剪至3mm以下角形状，分别称取20mg和50mg放入1.5mlMicrotube中，于-20℃冻结后按“操作方法”进行基因组DNA的提取，基因组DNA使用20μlTEBuffer溶解后，进行吸光度测定和电泳确认，电泳结果如下。每份样品分别平行提取了2个。拟南芥西红柿菠菜20mg50mg20mg50mg20mg50mgM123456789101112M：λ-HindⅢdigest150ng5μl提取液，1％Agarose电泳图1从植物组织中提取的基因组DNA电泳图-2-表1从植物组织中提取的基因组DNA纯度*样品名称样品量SampleNo.A260/A280A260/A23012.21.420mg22.21.432.11.7拟南芥幼芽50mg42.11.752.01.420mg62.01.671.81.4西红柿幼芽50mg81.71.492.21.620mg102.21.8112.11.8菠菜叶50mg122.01.7*：按照“操作方法”提取的基因组DNA中含有RNA，不能正确反映出基因组DNA的纯度。实验例2：从烟草BY-2培养细胞中提取基因组DNA将湿重50mg的烟草BY-2培养细胞放入1.5mlMicrotube中，使用PBSBuffer洗净，于-20℃冻结后省略了用PipetTip尖端将植物组织按压Microtube底部这一步骤，其余步骤按“操作方法”操作，沉淀用20μlTEBuffer溶解后，进行吸光度测定和电泳确认，电泳结果如下。每份样品分别平行提取了2个。12M5μl提取液，1％Agarose电泳M：λ-HindⅢdigest150ng图2烟草BY-2培养细胞中提取的基因组DNA电泳图表2从烟草BY-2培养细胞中提取基因组DNA的纯度*样品名称样品量SampleNo.A260/A280A260/A23012.22.1烟草BY-2培养细胞50mg22.22.2*：按照“操作方法”提取的基因组DNA中含有RNA，不能正确反映出基因组DNA的纯度。-3-实验例3：以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增以实验例1、2中提取的基因组DNA溶液为模板进行PCR扩增。Template：实验例1、2提取的基因组DNA溶液各0.5μlPCREnzyme：TaKaRaTaqHotStartVersion（TaKaRaCode：DRR006A）TotalVolume：25μl目的基因及扩增片段大小实验材料名称目的基因扩增片段大小拟南芥MERI-5基因约1.0kbp西红柿XET基因约0.6kbp菠菜coxl基因约0.5kbp烟草EXT基因约2.2kbpPCR反应条件：拟南芥，菠菜98℃10sec60℃30sec30Cycles72℃1min/kbp西红柿，烟草98℃10sec55℃30sec30Cycles72℃1min/kbp实验例2提取的基因组DNA实验例1提取的基因组DNA烟草BY-2拟南芥西红柿菠菜培养细胞20mg50mg20mg50mg20mg50mg50mgM12345678910111212M1.0kbp0.5kbp2.0kbpPCR反应液4μl，1％Agarose电泳，M：Wide-RangeDNALadder（50～10,000bp）图3以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增的电泳图-4-实验例4：从菠菜叶（10mg、100mg）中提取基因组DNA将菠菜叶用剪刀剪至3mm以下角形状，分别称取10mg、100mg放入1.5mlMicrotube中，于-20℃冻结后按“操作方法”进行基因组DNA的提取，使用20μlTEBuffer溶解后，进行吸光度测定和电泳确认，电泳结果如下。10mg100mgM12M121％Agarose电泳1：5μl提取液2：0.5μl提取液M：λ-HindIIIdigest150ng图4从菠菜叶（10mg、100mg）中提取的基因组DNA电泳图表3从菠菜（10mg、100mg）中提取基因组DNA的纯度*样品名称样品量SampleNo.A260/A280A260/A23010mg12.21.9菠菜叶100mg22.12.1*：按照“操作方法”提取的基因组DNA中含有RNA，不能正确反映出基因组DNA的纯度。实验例5：以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增以实验例4中提取的基因组DNA溶液为模板进行PCR扩增。Template：实验例4提取的基因组DNA溶液原液及稀释液2μlPCREnzyme：TaKaRaTaqHotStartVersion（TaKaRaCode：DRR006A）TotalVolume：25μl【目的基因及扩增片段大小】实验材料：菠菜目的基因：coxl基因片段大小：约0.5kbpPCR反应条件：98℃10sec60℃30sec30Cycles72℃30sec-5-10mg100mg1％Agarose电泳M123456M1234561：基因组DNA原液2：基因组DNA溶液2倍稀释液3：基因组DNA溶液5倍稀释液4：基因组DNA溶液10倍稀释液5：基因组DNA溶液20倍稀释液6：基因组DNA溶液40倍稀释液M：250bpDNALadderMarker图5以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增的电泳图Troubleshooting●1．DNA收量低、回收不到基因组DNA，怎么办？①由于植物组织的不同，基因组DNA回收量会有所不同，请增加初始组织量。②松、山茶等固体叶片可以使用液氮研磨后再提取基因组DNA。③使用Microtube用研磨棒代替PipetTip进行按压处理可能会提高收量。④添加异丙醇或者70％乙醇后的离心时间延长（添加异丙醇后的离心时间10分钟→30分钟、添加70％乙醇后的离心时间3分钟→30分钟等），可能会提高收量。⑤根据植物组织的保存时间、保存条件的不同，基因组DNA收量会有所不同，请尽量使用新鲜样品。2．PCR无扩增产物。①有时回收的基因组DNA溶液中含有PCR反应的阻害物质，请将基因组DNA溶液进行稀释后再作为PCR反应的模板使用。②初始组织量太多，请减少初始组织量。③基因组DNA溶液呈茶褐色时，可能混入了明胶类物质，使用High-SaltSolutionforPrecipitation（Plant）（TaKaRaCode：D9193）处理可能将缓和对PCR反应的阻害。使用High-SaltSolutionforPrecipitation（Plant）处理基因组DNA样品时，操作方法与处理RNA样品相同。但是不含PCR反应阻害物质的样品如果使用High-SaltSolutionforPrecipitation（Plant）处理后，相反有可能会引起对PCR反应的阻害，请注意！④PCR反应用酶的选择。要提高PCR反应的扩增效率，推荐使用MightyAmp™DNAPolymerase（TaKaRaCode：DR070）或者TaKaRaExTaq®HotStartVersion（TaKaRaCode：DRR006）。