DB21T 2288-2014 养殖水体中孔雀石绿残留量的测定 液相色谱串联质谱法

ICS71.040.40B04DB21辽宁省地方标准DB21/T2288—2014养殖水体中孔雀石绿残留量的测定液相色谱串联质谱法DeterminationofmalachitegreenresiduesinaquaculturewaterbyHPLC-MS/MSmethod2014-04-19发布2014-06-19实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T2288—2014I前言本标准是按照GB/T1.1—2009给出的规定起草的。本标准由大连市水产技术推广总站提出。本标准由大连市质量技术监督局归口。本标准起草单位：大连市水产技术推广总站。本标准主要起草人：张秀妍、李勃、丁勇、马琳、郝佳、王骏。DB21/T2288—20141养殖水体中孔雀石绿残留量的测定液相色谱串联质谱法1范围本标准规定了养殖水体中孔雀石绿残留量的测定-液相色谱串联质谱法的原理、试剂、仪器设备、测定步骤、结果计算、检出限、回收率和精密度。本标准适用于渔业生产养殖水体中孔雀石绿残留量的测定。本方法的检出限为0.05µg/L。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理样品中的孔雀石绿用乙腈和二氯甲烷液液萃取，反相色谱柱分离，质谱检测器检测，内标法定量。4试剂4.1乙腈：色谱纯。4.2二氯甲烷。4.3无水乙酸铵。4.4甲酸。4.5甲酸溶液[1+1000]:准确吸取1.00mL甲酸溶于1000mL水中，经0.22μm混合纤维素滤膜过滤。4.6乙酸铵缓冲溶液[5mmol/L]：称取0.385g无水乙酸铵溶解于1000mL水中，冰乙酸调pH到4.5。4.7乙腈-乙酸铵混合溶液（1+1）：500mL乙腈与500mL乙酸铵溶液（4.6）超声混合5min。4.8盐酸羟胺。4.9盐酸羟胺溶液[0.25g/mL]：称取25g盐酸羟胺溶于100mL水中。4.10对-甲苯磺酸。4.11对-甲苯磺酸溶液[1.0mol/L]：称取17.2g对-甲苯磺酸，用水溶解，并定容至100mL。4.12标准品：孔雀石绿（MG）、氘代孔雀石绿（D5-MG），纯度≥98%。DB21/T2288—201424.13标准储备溶液。4.13.1孔雀石绿标准储备溶液[1.0mg/mL]：准确称取10.00mg的孔雀石绿标准品，用乙腈配制成1.0mg/mL的标准储备溶液，﹣18℃避光保存，保存期3个月。4.13.2氘代孔雀石绿标准储备溶液[1.0mg/mL]：准确称取10.00mg的氘代孔雀石绿标准品，用乙腈配制成1.0mg/mL的标准储备溶液，﹣18℃避光保存，保存期3个月。4.14孔雀石绿标准工作溶液[100ng/mL、10.0ng/mL]：准确吸取孔雀石绿标准储备溶液（4.13.1），用乙腈逐级稀释配成100ng/mL和10.0ng/mL的工作溶液，﹣18℃避光保存，保存期7天。4.15氘代孔雀石绿标准工作溶液[100ng/mL]：准确吸取氘代孔雀石绿标准储备溶液（4.13.2），用乙腈逐级稀释配成100ng/mL的工作溶液，﹣18℃避光保存，保存期7天。注：除非另作说明，本方法所用试剂均为分析纯，试验用水符合GB/T6682一级水指标。5仪器和设备5.1高效液相色谱-串联质谱联用仪。5.2电子天平：感量0.01mg。5.3旋转蒸发仪。5.4旋涡振荡器。5.5超声波振荡器。6测定步骤6.1样品处理6.1.1吸取水样50.00mL，置于250mL分液漏斗中。向分液漏斗中加入20.0µL氘代孔雀石绿标准工作溶液（4.15）、1.5mL盐酸羟胺溶液（4.9）、2.5mL对-甲苯磺酸溶液（4.11），振摇混匀。6.1.2加入10.0mL乙腈、25.0mL二氯甲烷，剧烈振摇3min，静置分层10min，将下层溶液转移至125mL鸡心瓶中。6.1.3继续向分液漏斗中加入10.0mL乙腈、25.0mL二氯甲烷，剧烈振摇3min，静置分层10min，合并下层溶液于上述125mL鸡心瓶中，于45℃±2℃水浴中减压浓缩至近干。6.1.4向鸡心瓶中加入1.00mL乙腈-乙酸铵混合溶液（4.7），涡旋振荡1min、超声振荡1min，样液经0.22µm针孔式有机相滤膜过滤后供高效液相色谱-串联质谱联用仪测定。6.2空白试验准确量取50.00mL不含孔雀石绿的水样，按样品处理步骤进行。6.3测定DB21/T2288—201436.3.1色谱条件6.3.1.1色谱柱：C18柱，100mm×3.0mm（内径），粒度1.8µm。6.3.1.2流动相：乙腈＋甲酸水溶液（0.1%）=60+40（V/V）。6.3.1.3流速：0.25mL/min。6.3.1.4柱温：35℃。6.3.1.5进样量：10µL。6.3.2质谱条件6.3.2.1离子源：电喷雾ESI源，正离子模式。6.3.2.2扫描方式：多反应监测MRM。6.3.2.3雾化气压力：40psi。6.3.2.4雾化气温度：350℃。6.3.2.5雾化气、干燥气为高纯氮气，气体流量：10L/min。6.3.2.6碰撞气为高纯氮气，气体压力：0.15MPa。6.3.2.7监测离子对：孔雀石绿m/z329/313、329/208；氘代孔雀石绿m/z334/318。6.4标准曲线的配制检测前，吸取孔雀石绿标准工作溶液（4.14）、氘代孔雀石绿标准工作溶液[4.15]适量，用流动相配制成浓度分别为0.01ng/mL、0.05ng/mL、0.10ng/mL、0.50ng/mL、1.00ng/mL、2.00ng/mL、5.00ng/mL的混合标准系列工作溶液，每毫升该溶液含有氘代孔雀石绿2.0ng。将此混合标准系列工作溶液按6.3的仪器条件测定，孔雀石绿以氘代孔雀石绿为内标物，通过仪器工作站制定内标法标准曲线。6.5定性依据在同样测试条件下，阳性样品保留时间与标准物质保留时间相对标准偏差在±5%以内，且检测到的离子的相对丰度，用与最强离子（基峰）的强度百分比表示，应当与浓度相当的校正标准相对丰度一致。6.6定量测定将样品制备液按6.3测定，通过仪器工作站计算制备液中孔雀石绿的浓度。在上述条件下，标准溶液中孔雀石绿、氘代孔雀石绿的参考保留时间分别为2.203min、2.184min，标准溶液的色谱图及质谱图参见附录A。7结果计算DB21/T2288—201447.1制备液中孔雀石绿的浓度Ci由仪器工作站依据内标法标准曲线自动计算。7.2样品中孔雀石绿的含量按式（1）计算。计算结果需扣除空白值。21VVCiXi×=……………………………………………（1）式中：Xi—样品中孔雀石绿的含量，单位为微克每升（µg/L）；Ci—制备液中孔雀石绿的浓度，单位为微克每升（µg/L）；V1—最终定容体积，单位为毫升（mL）；V2—样品体积，单位为毫升（mL）。8检出限孔雀石绿的检出限为0.05µg/L。9回收率和精密度孔雀石绿添加浓度为0.05µg/L～5.00µg/L时，回收率为80%～110%。本方法的批内相对标准偏差小于10%，批间相对标准偏差小于15%。DB21/T2288—20145AA附录A（资料性附录）孔雀石绿和氘代孔雀石绿标准溶液的色谱图和质谱图图A.1孔雀石绿和氘代孔雀石绿标准溶液的色谱图图A.2孔雀石绿标准溶液的质谱图DB21/T2288—20146图A.3氘代孔雀石绿标准溶液的质谱图_________________________________