DB11T 507-2007 玉米品种纯度及真实性SSR分子检测方法

玉米品种纯度及真实性SSR分子检测方法SSR-basedMethodtoAssayPurityandGenuinenessinZeamaysL.ICS65.020.20B21备案号：21532-2007北京市地方标准DBDB11/T507—20072007-11-22发布2008-02-01实施北京市质量技术监督局发布DB11/T507—2007I前言本标准的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。本标准由北京市农业局提出。本标准由北京市农业标准化技术委员会种植业分会归口。本标准起草单位：北京市种子管理站、北京市农林科学院玉米研究中心、全国农业技术推广服务中心。本标准主要起草人：贾希海、郭景伦、辛景树、律宝春、田雷、吴明生、赵久然、王凤格、云晓敏、郭慧杰。DB11/T507—20071玉米品种纯度及真实性SSR分子检测方法1范围本标准依据SSR分子标记原理，规定了进行玉米单交种和亲本自交系的品种纯度及真实性检测方法的仪器设备及试剂、引物筛选、试验步骤、纯度检测和真实性鉴定。本标准适用于玉米单交种及亲本自交系的纯度及真实性检测。2术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2.1品种纯度varietalpurity品种在DNA分子标记带型方面典型一致的程度，用供检样品中本品种的种子数占样品种子总数的百分率表示。2.2品种真实性varietalgenuineness供检品种与标准品种的符合程度。2.3SSR分子标记simplesequencerepeatmarker由寡核苷酸为单位的简单串联重复序列。2.4引物primer结合在模板DNA上的互补短链，提供3＇-OH末端作为DNA合成的起点，延伸合成模板DNA的互补链。3原理在玉米基因组中普遍存在着由寡核苷酸为基本单位的简单串联重复序列，品种间因其重复次数不同而存在多态性，据此可以利用适宜引物进行PCR扩增，从而检测出特定SSR位点的多态性，以鉴别品种的纯度及真实性。4仪器设备及试剂4.1仪器设备PCR扩增仪；DNA序列分析电泳槽；高压电泳仪（3000V,400mA,400W）；电子天平（感量0.01g,0.001g）；冰箱；微量加样器（0.5µL～10µL,20µL～200µL,100µL～1000µL）；磁力搅拌器；胶片观察灯；水平摇床；高压灭菌锅；酸度计等。烧杯；镊子；刻刀；量筒；容量瓶（500mL，1000mL）；离心管（0.5mL，1.5mL）；吸头(10µL，200µL，1000µL)；注射器（100mL）；96孔深孔板；96孔PCR板；封板膜；一次性手套；离心管架；染色盒（55cm×38cm×8cm）；水平仪；夹子等。4.2试剂乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）；三羟甲基氨基甲烷（Tris）；盐酸（HCl，36%）；氢氧化钠(NaOH)；10倍PCR缓冲液（不含Mg2+），保存条件为-20℃；氯化镁（MgCl2）；四种脱氧核糖核苷酸（dNTPs），保存条件为-20℃；TaqDNA聚合酶（5U/µL），保存条件为-20℃；SSR引物，保存条件为-20℃；矿物油；DB11/T507—20072去离子甲酰胺；溴酚蓝；二甲苯青FF；甲叉双丙烯酰胺；丙烯酰胺；硼酸；尿素；亲和硅烷（BindingSilane）；剥离硅烷（RepelSilane）；无水乙醇；四甲基乙二胺；过硫酸铵；冰醋酸；硝酸银；甲醛溶液等。DNA提试剂、PCR反应试剂、电泳试剂和银染试剂的成分及配制按附录A执行。5引物筛选适宜引物筛选应遵守扩增后的杂交种SSR电泳谱带含有双亲谱带，而且带型清晰、重复性好的原则。可以利用已经公开发表的引物，也可以自行筛选引物。自行筛选时，取测试杂交种种子10粒及父母本种子各5粒，利用一系列引物进行分析，从中确定适宜的引物。常见适用于玉米品种的纯度及真实性分析的SSR引物名称及序列参见附录B。6方法步骤6.1DNA提取剥取种胚，分别放入96孔深孔板中。每孔加入150µLDNA提取液，盖封板膜，煮沸5min后，在每孔中加入150µLTE缓冲液，形成样品DNA溶液。样品DNA溶液可以直接进行PCR扩增或在冰箱中冷冻长期保存。6.2扩增取96孔PCR反应板一块，每孔中依次加入13.5μL超纯水、2μL10倍PCR缓冲液、2.5μLMgCl2（25mmol/L）、1.2μLdNTP(2.5mmol/L)、0.25μLSSR引物（20μmol/L）、0.25μLTaqDNA聚合酶(5U/μL)，混匀。每孔再加入2μL样品DNA溶液和1滴矿物油，盖封板膜后放入PCR仪，扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性40s，60℃退火35s，72℃延伸45s，循环35次；72℃延伸5min；4℃保存。6.3检测6.3.1胶板制作将玻璃板洗净，用无水乙醇擦洗两遍，干燥。在长玻璃板上涂0.5%亲和硅烷（BindingSilane）0.5mL，带凹槽的玻璃板上涂2.0%剥离硅烷（RepelSilane）0.5mL。操作过程中防止两块玻璃板互相污染。待玻璃板彻底干燥后，将长玻璃板水平放置，在玻璃板上面垂直方向两边放置边条，并与玻璃边缘对齐，然后，将带凹槽的玻璃板放在长玻璃板的上面，四周对齐，并在有边条的两边用夹子固定，水平仪调平。吸取4.5%PA胶80mL，加入四甲基乙二胺80μL和25%过硫酸铵80μL，迅速摇匀。在凹槽一端，沿灌胶口一边轻轻敲打，一边将胶灌进，灌胶过程中防止出现气泡。待胶流动到另一端，在凹槽一端，将梳子齿向外，轻轻的插入梳子，使其聚合1h以上。6.3.2预电泳在正极槽（下槽）和负极槽（上槽）中分别加入1倍TBE缓冲液600ml，拔出梳子，90W恒功率预电泳15min～20min。6.3.3点样20μlPCR扩增样品加入4μl6倍加样缓冲液，混匀后，在PCR仪上变性：95℃变性5min，4℃冷却10min。用吸球吹吸加样槽,清除气泡和残胶，插入样品梳子，每一个加样孔点入5μl样品。6.3.4电泳80W恒功率电泳30min。6.3.5染色电泳结束后，分开两块玻璃板。将带凝胶的玻璃板浸入固定液中轻轻晃动3min，再放入去离子水中漂洗10s，然后将胶板放入染色液中染色5min。DB11/T507—20073将染色后的胶板放入去离子水中漂洗10s，然后在显影液中轻轻晃动直至带纹清晰。将显影后的胶板放入固定液中定影5min，再用去离子水漂洗1min。7纯度检测7.1取样从送检样品中随机取不少于100粒种子。7.2SSR分析按照本标准第6章规定的方法步骤进行。7.3数据计算和表示100%×−=供检种子粒数非本品种种子粒数供检种子粒数（自交系）品种纯度100%×−−=供检种子粒数其他类型种子粒数母本种子粒数供检种子粒数（单交种）品种纯度8真实性鉴定8.1取样分别从送检样品和标准样品中各随机抽取10粒种子。8.2SSR分析利用40对SSR核心引物，按照本标准第6章规定的方法步骤进行。对样本间存在差异的引物和样本内个体之间存在差异的引物，从送检样品和标准样品中分别重新取样进行复检。8.3结果判定送检样品与标准样品之间未检测出差异，判定送检样品与标准样品属于同一品种。送检样品与标准样品有一对以上（包括一对）引物检测出差异，判定送检样品与标准样品不属于同一品种。送检样品或标准样品存在两种或两种以上带型，以出现次数最多的一种带型作为该样品典型带型。DB11/T507—20074附录A（规范性附录）主要试剂配制A.1DNA提取试剂配制A.1.110mol/L氢氧化钠（NaOH）溶液：取NaOH80g，先用160mL蒸馏水溶解后，再加水定容至200mL。A.1.20.5mol/LEDTA（pH8.0）：取EDTA-Na2186.1g，加入100mL蒸馏水，再加入适量10mol/LNaOH溶液，加热至完全溶解后，冷却至室温，用10mol/L氢氧化钠溶液调pH值至8.0，加水定容至1000mL，高压灭菌。A.1.31mol/LTris-HCl（pH8.0）：取三羟甲基氨基甲烷(Tris)60.55g溶于适量蒸馏水中，用盐酸(HCl)调pH至8.0，加水定容至500mL，高压灭菌。A.1.4TE缓冲液（pH2.0）：取1mol/LTris-HCl（pH8.0）5mL和0.5mol/LEDTA（pH8.0）1mL，用盐酸(HCl)调pH至2.0，加蒸馏水定容至500mL，高压灭菌。A.1.5DNA提取液：取NaOH2g，先用200mL蒸馏水溶解，再加水定容至500mL，高压灭菌。A.2PCR扩增试剂配制A.2.1dNTPs：用超纯水分别配制ATP、GTP、CTP、TTP终浓度为100mmol/L的储存液，各取20μL混合，加入720μL超纯水定容至终浓度2.5mmol/L。A.2.2SSR引物：用超纯水分别配制左引物（L）和右引物（R）终浓度均为40μmol/L的储存液，等体积混合成20μmol/L。A.3凝胶与电泳试剂配制A.3.16倍加样缓冲液：取去离子甲酰胺49mL，加入0.5mol/LEDTA（pH8.0）1mL，溴酚兰0.125g，二甲苯青FF0.125g，混匀。A.3.210倍TBE缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷（Tris）108g，硼酸55g，加适量去离子水溶解后，再加入0.5mol/LEDTA（pH8.0）37mL，加水定容至1000mL。A.3.340%PA胶：取丙烯酰胺190g和甲叉双丙烯酰胺10g，先用400mL去离子水溶解后，再加水定容至500mL。A.3.44.5%PA胶：取尿素450g，加入10倍TBE缓冲液100mL和40%PA胶112.5mL，加去离子水定容至1000mL。A.3.5亲和硅烷（BindingSilane）缓冲液：取无水乙醇49.75mL和冰醋酸250µL，混合。A.3.60.5%亲和硅烷（BindingSilane）：在9.95mL亲和硅烷缓冲液加入50µL亲和硅烷原液，混匀。A.3.725％过硫酸铵：取0.25g过硫酸铵，加1mL去离子水溶解，现用现配。A.3.81倍TBE缓冲液：取10倍TBE500mL，加4500mL去离子水混匀。A.4银染试剂配制A.4.1固定液：取冰醋酸100mL，加去离子水定容至1000mL。A.4.2染色液：取硝酸银2g，加去离子水定容至1000mL。A.4.3显影液：取氢氧化钠30g和甲醛5mL，加去离子水定容至1000mL。DB11/T507—20075附录B（资料性附录）常用的SSR引物表B.1玉米品种纯度检测常用的SSR引物编号引物名称引物序列1bnlg439左引物（L）:5＇-TTGACATCGCCATCTTGGTGACCA-3＇右引物（R）:5＇-TCTTAATGCGATCGTACGAAGTTGTGGAA-3＇2bnlg161左引物（L）:GCTTTCGTCATACACACACATTCA-3＇右引物（R）:ATGGAGCATGAGCTTGCATATTT-3＇3bnlg125左引物（L）:GGGACAAAAGAAGAAGCAGAG-3＇右引物（R）:GAAATGGGACAGAGACAGACAAT-3＇4bnlg198左引物（L）:GTTTGGTCTTGCTGAAAAATAAAA-3＇右引物（R）:GCTGGAGGCCTACATTATTATCTC-3＇5bnlg238左引物（L）:CTTATTGCTTTCGTCATACACACACATTCAT-3＇右引物（R）:GAGCATGAGCTTGCATATTTCTTGTGG-3＇6bnlg240左引物（L）:AAGAACAGAAGGCATTGATACATAA-3＇右引物（R）:TGCAGGTGTATGGGCAGCTA-3＇7bnlg107左引物（L）:GCAACTAGAAGTAGATGGCTTGTTATGG-3＇右引物（R）:CAACAACAAGTGGCTGGCTAGGGTGAA-3＇8phi034左引物（L）:TAGCGACAGGATGGCCTCTTCT-3＇右引物（R）:GGGGAGCACGCCTTCGTTCT-3＇9phi053左引物（L）:CTGCCTCTCAGATTCAGAG