2021年办公室主任交流发言材料稿和县委经济工作会议讲话范例

33第22卷第12期2020年12月辽宁中医药大学学报JOURNALOFLIAONINGUNIVERSITYOFTCMVol.22No.12Dec.，2020蛇床子素长循环脂质体对APP/PS1小鼠神经保护作用李婉嫕，孔亮，蔺莹，梁喜才，姚璎珈，陈吉聪，杨静娴（辽宁中医药大学药学院，辽宁大连116600）基金项目：国家自然科学基金（81210108050）作者简介：李婉嫕（1996-），女，辽宁锦州人，硕士研究生，研究方向：中药神经药理学。通讯作者：杨静娴（1963-），女，辽宁大连人，教授，博士研究生导师，博士，研究方向：神经药理学。E-mail：[e-mail]。摘要：目的探究蛇床子素长循环脂质体（Ost-Lips）对APP/PS1小鼠的神经保护作用。方法利用薄膜分散法制备Ost-Lips；将6月龄APP/PS1双转基因小鼠随机分为模型组、蛇床子素游离药组（Ost，10mg/kg）、Ost-Lips组（10mg/kg），以同龄C57BL/6小鼠为对照组，每日1次腹腔注射相应药物，模型组和对照组注射相同体积的生理盐水，连续6周。免疫荧光染色检测皮层及海马区β-淀粉样蛋白1-42（Aβ1-42）、小胶质细胞特异性标志物离子钙结合衔接分子1（Iba-1）的表达；酶联免疫吸附测定法（ELISA）评价神经组织炎症因子白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）的水平；超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）试剂盒法验证药物对神经组织的保护作用；6周给药后进行Morris水迷宫实验，训练5d记录逃避潜伏期及游泳距离，最后1d记录穿越原平台次数以及停留原平台所在象限的时间。结果给药6周后，Ost-Lips明显较Ost更有效的减少APP/PS1双转基因小鼠脑Aβ1-42的沉积，减少胶质细胞过度活化，抑制炎症因子的释放，降低脑内SOD、MDA的水平，并能更好的提高APP/PS1双转基因小鼠的学习与记忆能力。上述结果与模型组相比，差异均具有统计学意义（P0.01或P0.05）。结论初步证明Ost-Lips对APP/PS1小鼠具有比Ost更有效的神经保护作用。关键词：蛇床子素；长循环脂质体；阿尔茨海默病；神经保护作用中图分类号：R285.5文献标志码：A文章编号：1673-842X(2020)12-0033-05NeuroprotectiveEffectofOstholeLongCirculatingLiposomeonAPP/PS1MiceLIWanyi，KONGLiang，LINYing，LIANGXicai，YAOYingjia，CHENJicong，YANGJingxian（CollegeofPharmacy，LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine，Dalian116600，Liaoning，China）Abstract：ObjectiveToinvestigatetheprotectiveeffectsofostholelongcirculatingliposome（Ost-lips）onAPP/PS1mice.MethodsPreparationofOst-Lipsbythinfilmdispersionmethod.The6-month-oldAPP/PS1doubletransgenicmicewererandomlydividedintoamodelgroup，aostholefreemedicinegroup（Ost，10mg/kg），anOst-Lipsgroup（10mg/kg），andC57BL/6miceofthesameageweresetasthecontrolgroup.Therelevantmedicinewereinjectedintraperitoneallyonceaday，themodelgroupandthecontrolgroupwereinjectedintraperitoneallywiththesamevolumeofnormalsalinefor6weeks.Immunohistochemicalmethodwasusedtodeterminetheexpressionofβ-amyloidprotein1-42（Aβ1-42）andmicroglialcellspecificmarkerioncalciumbindingadaptormolecule1（Iba-1）.ELISAwasusedtoevaluatethelevelsofinflammatoryfactors[interleukin1β（IL-1β），interleukin6（IL-6），tumornecrosisfactorα（TNF-α）]inneuraltissues.Superoxidedismutase（SOD）andmalondialdehyde（MDA）kitmethodstoverifytheprotectiveeffectofmedicineonneuraltissues.TheMorriswatermazeexperimentwasperformedafter6weeksofadministration.Theescapeincubationperiodandswimmingdistanceofmicewererecorded5dduringlearning.Thetimesofcrossingtheoriginalplatformandthetimespentinthequadrantwheretheoriginalplatformwaslocatedinthelastday.ResultsAfter6weeksofadministration，comparedwithOst，Ost-lipscaneffectivelyreducethedepositionofAβ1-42inthebrainofAPP/PS1mice，reducetheoveractivationofglialcells，inhibitthereleaseofinflammatoryfactors，reducethelevelofSODandMDAinthebrain，andsignificantlyimprovethelearningandmemoryabilityofAPP/PS1mice.Comparedwiththemodelgroup，theaboveresultsarestatisticallysignificant（P0.01orP0.05）.ConclusionItispreliminarilyprovedthatOst-LipshasmoreeffectiveneuroprotectiveeffectonAPP/PS1micethanOsthole.Keywords：osthole；longcirculatingliposome；Alzheimer'sdisease；neuroprotectiveeffect阿尔茨海默病（Alzheimer'sDisease，AD）是一种中枢神经退行性疾病，随着年龄的增加，发病率逐渐上升，目前仍未找到安全有效的治法以及潜在预防AD的方法[1-2]。β-淀粉样蛋白（β-amyloidprotein，Aβ）假说在AD发病机制中占主导地位，Aβ产生神经毒性、氧化应激反应等，在AD的发生和发展过程中具有重要作用[3-5]，所以靶向抑制Aβ是防治AD的关键。蛇床子素（Osthole，Ost）是一种具有强药理活性的天然香豆素类化合物，如抗炎[6]、抗氧化[7]等，本实验室前期证明其具有良好的对抗AD作用[8-10]，但Ost不溶于水、生物利用度低、脑靶向性差等缺点都限制了其疗效的发挥。脂质体（Liposomes，Lips）是一种新型纳米级给药系统，其尺寸小，可以与细胞膜融合，提高药物的生物利用度[11]，是一种理想的可透过血脑屏障的给药系统[12]，但脂质体包载Ost治疗AD目前尚未见报道。DOI：10.13194/j.issn.1673-842x.2020.12.00834辽宁中医药大学学报22卷因此，本实验利用薄膜分散法制备蛇床子素长循环脂质体（Ost-Lips），以APP/PS1双转基因小鼠为AD模型，评价Ost-Lips治疗AD的作用，为临床治疗AD找寻新方法。1材料1.1仪器精密电子天平（FA1004，北京赛多利斯公司）；超声波细胞粉碎机（JY92-IIN，宁波新芝公司）；旋转蒸发仪（圣叶St-2000，上海亚荣生化仪器厂）；高效液相色谱仪（LC-2010AHT，日本岛津公司）；Morris水迷宫仪（MS-1，成都仪器厂）；荧光倒置显微镜（Ti-S，日本Nikon公司）；酶标仪（MR-96A，深圳迈瑞公司）；超低温冰箱（DW-86L386，青岛海尔公司）。1.2药品与试剂卵磷脂（EPC）、胆固醇（Chol）（美国AvantiPolarLipses公司）；二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-PEG2000）（日本NOF公司）；蛇床子素标准品（成都普菲德公司）；白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（上海朗顿公司）；Aβ1-42抗体（美国CST公司）；Iba-1抗体（美国Proteintech公司）；三氢-吲哚菁类（Cy3）染料、异硫氰酸荧光素（FITC）标记IgG抗体（美国Jackson公司）；超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）试剂盒（南京建成生物工程研究所）；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（上海碧云天公司）；其余试剂均为国产分析纯。1.3动物6月龄SPF级APP/PS1双转基因小鼠，体质量（20±2）g，购自北京中科泽晟生物技术有限公司，合格证号：SCXK（京）：2013-0002；6月龄SPF级C57BL/6小鼠，体质量（20±2）g，购自辽宁长生生物技术有限公司，合格证号：SCXK（辽）：2016-0001。小鼠分笼饲养，室温维持在22~25℃，12h光照。2方法2.1蛇床子素长循环脂质（Ost-Lips）的制备按薄膜分散法制备Ost-Lips[13-14]。按处方量称取EPC、Chol、DSPE-PEG2000加入适量甲醇超声溶解，40℃水浴旋转蒸发成均匀脂膜，加Tris碱（pH=8.2）5mL，超声至完全溶解，置于超声波细胞粉碎机（200W）超声10min，过0.22μm微孔滤膜3次，即得Ost-Lips。经HPLC检测所制脂质体包封率为94.18%，可用于以后实验。2.2分组与给药所有6月龄的APP/PS1双转基因小鼠随机分为模型组（APP）、蛇床子素游离药组（Ost，10mg/kg）、蛇床子素长循环脂质体组（Ost-Lips，10mg/kg），以同龄C57BL/6小鼠为对照组（Control）。给药组小鼠每日腹腔注射1次，连续6周。对照组予以等体积的生理盐水。2.3免疫荧光染色检测Aβ1-42及Iba-1的表达脑组织切片置于4%多聚甲醛固定30min，磷酸缓冲盐溶液（PBS）润洗3次；加入1%TritonX-100透化30min，PBS润洗3次；5%牛血清白蛋白（BSA）溶液封闭1h，不洗，分别加入Aβ1-42、Iba-1一抗（1∶300），置于湿盒中，4℃孵育过夜；次晨，PBS润洗3次，然后加Cy3或FITC标记二抗（1∶300），室温避光孵育1h，PBS润洗3次；DAPI染核15min，PBS润洗3次，于荧光显微镜下观察。2.4ELISA检测脑内炎症因子水平取小鼠海马组织，称重，剪碎，加入9倍量生理盐水，冰浴匀浆，10000r/min，离心10min，收集上清液，-80℃保存。严格按照ELISA试剂盒使用说明操作，检测组织中IL-1β、IL-6及TNF-α的含量。2.5脑内氧化应激水平检测取10%匀浆液，严格