Bio-Plex悬液芯片系统简明使用教程(2008修订版)

Bio-Plex悬液芯片系统简明使用教程（2008修订版）Bio-Plex悬液芯片系统一、仪器名称：Bio-Plex悬液芯片系统二、规格型号：Bio-Plex200System三、生产厂家：Bio-RadLaboratories,Inc四、产品简介人类基因组计划（HGP）的完成和蛋白质组计划（HPP）的启动，获得了数量巨大的基因和蛋白质信息，而要对如此庞大的信息进行全面的处理和研究，必须设计和利用更为高效的硬件和软件技术，建立新型、高效、快速的检测分析方法。生物芯片正是在这种背景下应运而生，其不仅在高通量基因测序、基因表达研究、蛋白质相互作用等方面发挥重要作用，也将在临床诊断中占据重要地位[1]。液相芯片（liquichip）是新一代生物芯片技术，既能为后基因组时代科学研究提供强大的技术支持，又能提供高通量的新一代分子诊断技术平台。Bio-Plex悬液芯片系统将先进的软件包、系统检验工具、微球耦联试剂和即用型细胞因子与磷酸化蛋白测试试剂整合在一起，使硬件、软件和检测试剂形成一个功能强大的芯片技术平台，大大提高了结果的精确性和可重复性，使用更加简便高效。该系统为蛋白与核酸研究人员提供了灵活的复合测试方案，可在单个样品中同时分析多达100个生物分子。利用100种不同颜色微球（xMAP技术）标记生物分子配体，每个微球可耦联一个对应不同靶分子的特异反应物。反应物可以是酶底物、受体、抗原或者抗体。检测范围0.2-3200pg/ml或1.95-32000pg/ml，自动的校正和校验工具可以保证样品间差异、板间差、系统间差异控制在10%以下，30分钟可以完成96个样品的检测并获得多达10,000个分析数据。多重检测获得的数据可以完全揭示生命分子的相互关系及信号传导途径。[1]HulseRE,KunklerPE,FedynyshynJP,etal.Optimizationofmultiplexedbead-basedcytokineimmunoassaysforratserumandbraintissue.JNeurosciMethod,2004,136:87-98.五、技术原理1、芯片原理：Bio-Plex悬液芯片的核心技术是把微小的颗粒亦称微球（bead或microsphere）分别染成不同的荧光色，然后再把针对不同检测物的蛋白质或寡核苷酸探针以共价的方式吸附到不同颜色的微球上。微球直径为5.6um，其制作过程按照严格的搭配比例掺入两种不同的红色分类荧光染料，根据比例不同可以把球型基质分类为100种，每种标上不同的探针分子，从而可以对一个样本中多达100种不同的目的分子进行同步检测。在液相蛋白芯片中，先把针对不同检测物的不同颜色微球混合，然后加入被检测物，在悬液中微球与被检测物特异性结合，并加上荧光标记。由于多种颜色微球可以放在同一反应体系中，所以可以同时对一份标本的上百个指标进行检测。在液相基因芯片中，待测核酸可在聚合酶链式（PCR）扩增中直接加入荧光标记，经过与微球反应后可进行检测。2、检测原理：如上图所示，微球被鞘流液体传送系统排成单列通过两束激光，一束判定颗粒的颜色（分类激流动池报告激光532nm分类激光635nm光电倍增管光）从而决定被测物的类型和性质（定性），另一束（报告激光）测定颗粒上的荧光标记强度，从而决定被测物的量（定量）。所得信号经过光电倍增管后经电脑处理，所得数据可以直接用来判断结果。两束激光分别分析微球上的荧光颜色（特异性）和杂交信号（敏感性），而且激光只分析颗粒一定半径的信息，所以检测特异性强，信躁比高，背景低。六、结构组成七、仪器操作规程1、MCV板介绍：MCV板是用于维护（maintenance）、校正（calibration）和校验（Validation）的操作板，大小与一般96孔板相同，如下图所示：左上角两小孔用于Calibration（仪器校正），箭头所示的右边部分用于Validation（校验）。仪器的每一步操作在屏幕上都有MCV板的黄色闪烁操作提示，则在进行操作前必须在闪烁部分加入MCV板上提示的试剂。2、开机：注意：如果没配HTF，在开机前必须确认鞘流液瓶的鞘流液已经充满（液位在上端出口下），废液瓶必须倾空，并确认两个瓶子与仪器连接完好。如果配有HTF的机器，必须检查鞘流液桶的鞘流液是否足够。打开仪器电源，点击电脑桌面的Bio-PlexManager按钮，进入软件界面。3、Startup和仪器预热（warmup）：点击工具栏上的Startup按钮，在弹出的窗口中按照黄色闪烁提示将相应的试剂加入到MCV板中，如下图所示，点击该窗口下方的Enter/RetractPlate键，弹出微孔板平台，将MCV板平放在平台上，再按Enter按钮，将MCV板推进仪器中，昀后按OK按钮确定，开始进行StartUp。用于Calibration用于ValidationStartup结束后，点击工具栏上的按钮，将MCV板取出，然后开始进行仪器预热，点击工具栏上的预热按钮，仪器开始自动预热，一般预热30min。4、校正（Calibrate）：预热结束后进行仪器校正，点击工具栏上的校正按钮，屏幕弹出如下窗口：输入用户名，选择Calibratekit的批号（ControlNumber），CAL1和CAL2的批号在Calibratekit的瓶子上都有显示，点击该窗口上的Add按钮将该数据输入电脑，如果已经输好，只需选择即可。注意：如果是Bio-PlexManager4.1或以下版本软件，在选择CAL2的ControlNumber时要确定当次检测的灵敏度范围，选择HighRP1（高灵敏度，0.2-3200pg）或LowRP1(低灵敏度，1.95-32000pg)的ControlNumber。如果是昀新的Bio-PlexManager5.0版软件，则无需在Calibrate时选择灵敏度范围，而是在Run界面直接选择。按OK确定，屏幕弹出MCV板提示窗口：加入黄色闪烁所提示的试剂，然后将MCV板推入仪器，按OK开始进行仪器校正。注意：Calibratekit中的试剂CAL1和CAL2在加入前必须从2-8℃恢复到室温，并进行漩涡混合30秒以上才能使用，每孔加入5滴，DI水加入3.5mL。加入去离子水和70％异丙醇各3.5ml点击弹出微孔板平台5、创建和运行方法Protocolsetting和Runprotocol：点击工具栏的New按钮，屏幕即打开方法编辑Protocol窗口，如下图所示：Step1：输入方法的一般信息Step2：选择分析样本：如上图所示，选择分析物后，按AddAll将其移到选择栏中（Selected）。如果要增加分析物组合，点击AddPanel按钮，弹出窗口：输入该分析物组合名称，点击右边的Add按钮，弹出上面的右边窗口，将新的kit上的微球编码输入Region栏，把该微球对应的检测物名称输入到Name中，如果要继续增加分析物，点击Addcontinue按钮，如果编辑结束，则点击Add按钮。然后回到SelectAnalyte界面进行选择。点击各个按钮进行方法设置方法描述选择分析物板格式化输入标准品信息输入Control信息输入样本信息运行方法下拉选择分析物增加、编辑分析物组合Step3：板格式化：必须对板中各空的分析样本进行规定，以便仪器在读板中自动识别。点击FormatPlate后，如下图：左上角为三个按钮分别为：自动全部重复编码，自动横向重复和自动纵向重复，数字框为规定复孔数目。例如，标准品有8个，要做2复孔，则复孔选择2，鼠标点击横向重复编码按钮，然后鼠标在屏幕所示的板上按标准品所加的位置进行拖动，如从A1孔拉到H2孔，即可得到如上图的格式，对待检样本、对照和背景也同样操作，如果不做复孔则复孔栏选1。PlateGroupings此工具用来把孔分群，每一群中可以设置一个参照孔。群中每个孔的荧光强度相对于参照空的荧光强度的比值将被计算出来。芯片阅读仪只能对格式化后的孔进行阅读，但板的分群是可选的，也可以在读孔后进行设置。具体操作及说明在进行了孔的格式化后，可进行分群。点击PlateGroupings显示板分群工具。首先在Ratio区下拉菜单中设置每群需要计算的比率形式：Reference/Member或Member/Reference。依次为Blank（背景），Control（对照），Standard（标准品），X（待检样本），取消孔设定依次是Select（选择），Group（分群），Reference（参照），Ungroup（不分群，取消孔设置）定义群点击Group进行实验组分群设置，在实验中需要设置的孔的位置上拖动鼠标进行设置。注意：在进行分群前，孔必须已被设定为Sample，Standards，Control或blanks。可以把几种不同类型的孔设为一群（如：一个群中可以包括Standards，Samples，Controls或/和Blanks）。复孔将自动的被放在相同的群中（即使鼠标只拖动了复孔中的一个孔）。被分群的孔的颜色会有所变化，群中昀小标号的孔将被默认为参照孔。每群都会被赋予一个不同的颜色。点击UngroupSample按钮，点击或拖动孔或群可以从群中删除个别孔，或删除整个群。定义参照孔点击Reference按钮可以改变群中参照孔，点击需要设定的参照孔即可。对于复孔来说，群中所有编号相同的复孔将自动被定义为相同的参照。Step4：输入标准品信息：如下图所示，Step5：输入对照样本信息（Controlinformation）如果当此实验有对照样本，则该步必须进行编辑，如果没有对照样本，则该步骤可跳过，直接编辑Step6。如下图，选择分析物，输入对照样本的浓度和稀释倍数即可。选择分析物，一般所有分析物的浓度都相同输入各个分析物标准品的浓度选择后，再在下方输入分析物的初始浓度和稀释倍数，点击Calculate按钮，左边标准品浓度将自动计算并输入输入标准品浓度单位选择偏差值，一般为70-130%选择回归参数模型，一般为指数5PL，右边选择输出标准曲线的横坐标和纵坐标类型，该2种参数也可在结果输出后进行修改或编辑Step6：输入待检样本信息：方法编辑结束后可点击工具栏上的保存按钮，将方法保存到指定的文件夹中。Step7：运行方法：将板推进仪器中，点击屏幕runProtocol按钮，在该界面中选择每region100beads和50uL样品大小，如果是Bio-PlexManager5.0或一上版本，还需选择检测灵敏度（高灵敏度范围：0.2-3200pg/ml或低灵敏度范围：1.95-32000pg/ml）。然后点击右上角的Start按钮，屏幕则弹出要求是否自动保存结果，可选择该项，在继续弹出的窗口中选择运行结果要保存的文件夹，按OK后，则开始读板，读板过程如下图所示：运行界面（柱状图和点状图）设置及选项说明软件中的RunProtocol窗口可以控制程序的运行，运行状态有两种窗口可以显示：原始数据表格显示和柱状图/点状图显示。点击Show/HideHistogram/BeadMap按钮可显示原始数据表格，或板格式化后的孔对应的样本输入各孔样本名称，也可记在实验记事本中输入各孔样本稀释倍数如果所有样本稀释倍数相同，则可在此输入稀释倍数，然后自动计算是同时显示原始数据及柱状图/点状图（原始数据表格显示在柱状图/点状图下面，在窗口昀大化后可同时显示出来）。运行过程中，柱状图/点状图是在不断更新的，原始数据在阅读仪读取完成后可显示。在设置好运行选项后，点击右上角的Start按钮，RunProtocol对话框出现，输入使用者名字及微板的条形码或ID号（此项可不填）。点击Eject/RetractPlate，并放入微板，点击OK开始运行。以下情况可能会使运行延迟：阅读器光学系统没有预热，阅读仪将等到预热完成后开始运行。液流系统压力过低，会有警告信息出现，提示使用者检查鞘流液水平，软管的连接等等。平台的加热器不在特定的温度，警报信息出现，提示使用者等待温度改变。运行开始时，样品针将降低从平板的空中吸取样品，并