高效液相色谱分离芳香烃

实验八高效液相色谱法分离芳香烃一、实验目的1、了解高效液相色谱法的原理。2、学习高效液相色谱的操作方法。3、掌握高效液相色谱法分离芳香烃的一般步骤及过程。二、实验原理色谱法是利用不同物质在固定相和流动相中具有不同的分配系数，当两相作相对移动时，使这些物质在两相间进行反复多次分配，使原来微小的分配差异产生了很明显的分离效果，从而依先后顺序流出色谱柱，通过适当的检测手段，对分离后的各组分进行测定。高效液相色谱是选用颗粒很细的高效固定相，采用高压泵输送流动相，分离、分析、定性及定量全部分析过程都通过仪器来完成的一种重要液相色谱法。除了有快速、高效的特点外，它能分离沸点高、分子量大、热稳定性差的试样。它的定性方法是用与标准品对照的方法，即采用保留时间对照法，当某两种物质在相同的色谱条件下保留时间相同时，就认为是同一种物质。它的定量方法有很多，如外标法、内标法、面积归一法等。我们采用面积归一法，即用一定量的标准品进样，记录其峰面积，然后进未知样品，根据未知样品的峰面积与标准品的面积比，计算某物质的含量。计算公式：其中Wi是未知物中被测物的浓度或质量，Ws是标准品的浓度或质量，Ai、As分别是被测物和标准品的峰面积（设定两者进样量相同）。三、高效液相色谱仪的构造（Waters600E高效液相色谱仪）1、高压输液系统：贮液器、高压泵、过滤器和梯度洗脱装置2、进样系统3、分离系统：柱系统（150mm×4.6mm，n-C18柱）4、检测器：2487紫外检测器5、控制和数据处理系统Wi=AiWsAs四、试剂1、流动相：80%甲醇（色谱纯）+20%水（经0.45μm膜过滤）（使用前超声波脱气）。2、微量注射器：50μL。3、苯、甲苯（均为A.R）、二甲苯；样品（苯、甲苯、二甲苯）混合物均用甲醇（色谱纯）配制五、实验步骤1、接通电源，启动四元高压泵。设定A泵为运行泵、流速为0.8mL/min，用流动相平衡色谱柱30min。2、打开紫外检测器，输入所需波长：254nm。3、打开电脑，在开始→程序→M32打开操作程序。进行方法设置4、点击moniter，监视基线5—10min。5、基线平稳后，点击工作栏上方的“停止”键，点击“进样”键。6、用微量注射器抽取40—50μL标样，针头朝上排出气泡后，扎入进样孔（进样阀柄应处于向上位置），快速注射，迅速将进样阀柄扳下。7、待样品峰全部显示后，再进行标样2及样品的测试（按6、7步进行）。8、点击工作栏上方的“查看”，进行保留时间、面积积分记录。9、实验做完后，用甲醇作流动相，冲洗色谱柱30min，进行封柱。10、关机：先关程序，然后关紫外检测器、四元高压泵，最后关电源。六、数据处理1、测定每一个标准样品的保留时间和峰面积。2、测定未知样中每一个峰的保留时间，与标准样色谱图比较，标出未知样中每一个峰代表什么化合物。3、测定未知样中每一个峰的峰面积，用标准样品的峰面积，计算未知样中相应化合物的含量。七、思考题1、在该色谱条件下，苯、甲苯和二甲苯的保留时间各是多少？2、如何确定混合样中各组分的含量？