SNT 2206.6-2010 化妆品中微生物检验方法 第6部分 破伤风梭菌

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２２０６．６—２０１０化妆品微生物检验方法第６部分：破伤风梭菌犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犿犻犮狉狅犫犻狅犾狅犵犻犮犪犾犻狀犮狅狊犿犲狋犻犮狊—犘犪狉狋６：犆犾狅狊狋狉犻犱犻狌犿狋犲狋犪狀犻２０１００１１０发布２０１００７１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书中华人民共和国出入境检验检疫行　业　标　准化妆品微生物检验方法第６部分：破伤风梭菌ＳＮ／Ｔ２２０６．６—２０１０中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６　６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６　印张０．５　字数９千字２０１０年４月第一版　２０１０年４月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２０６７９　定价１４．００元书书书前　　言　　ＳＮ／Ｔ２２０６《化妆品微生物检验方法》分为以下部分：———第１部分：沙门氏菌；———第２部分：需氧芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌；———第３部分：肺炎克雷伯氏菌；———第４部分：链球菌；———第５部分：肠球菌；———第６部分：破伤风梭菌。本部分为ＳＮ／Ｔ２２０６的第６部分。本部分的附录Ａ为规范性附录。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。本部分主要起草人：范放、朱海、唐少冰、赵芳、匡燕云。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２２０６．６—２０１０化妆品微生物检验方法第６部分：破伤风梭菌１　范围ＳＮ／Ｔ２２０６的本部分规定了化妆品中破伤风梭菌的检测方法。本部分适用于各类化妆品中破伤风梭菌的检测。２　规范性引用文件下列文件中的条款通过ＳＮ／Ｔ２２０６本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。ＧＢ／Ｔ１９４８９　实验室　生物安全通用要求化妆品卫生规范（卫生部，２００７）３　方法提要根据破伤风梭菌特有的形态、生物学特征及培养特性，采用厌氧培养法，应用血琼脂平板进行分离，并根据该菌在血平板上菌落周围产生β型溶血环，呈迁徙性生长，革兰阳性梭菌，过氧化氢酶阴性等特征以兹鉴别，以小白鼠毒力试验为最终结果判定，对化妆品中可能存在的破伤风梭菌进行定性检验。４　设备和材料４．１　培养箱：３６℃±１℃。４．２　显微镜。４．３　厌氧培养装置。４．４　天平：量程１ｋｇ，感量０．１ｇ。４．５　灭菌样品处理器具：取样勺、剪刀等。４．６　样品稀释瓶、试管、吸管、平皿、接种环、载玻片等。４．７　注射器：１ｍＬ。４．８　小白鼠。５　培养基和试剂５．１　生理盐水（见附录Ａ第Ａ．１章）。５．２　庖肉培养基（见附录Ａ第Ａ．２章）。５．３　血琼脂平板（见附录Ａ第Ａ．３章）。５．４　革兰氏染色液。５．５　过氧化氢酶试验试剂。５．６　破伤风抗毒素。６　破伤风梭菌检测方法６．１　检测程序破伤风梭菌的检测程序见图１。１犛犖／犜２２０６．６—２０１０图１　破伤风梭菌检测程序示意图６．２　操作步骤６．２．１　取样不同类型化妆品的检样制备参照《化妆品卫生规范》。６．２．２　增菌培养取１∶１０样品稀释液１ｍＬ，共３份，分别加至３管庖肉培养基中，其中一管加入新鲜培养的破伤风梭菌对照菌液０．０５ｍＬ，为阳性对照。另取一管为阴性对照。将以上各管移入厌氧装置或厌氧培养箱３６℃±１℃培养４８ｈ～７２ｈ。阳性菌使肉汤混浊，肉渣部分被消化，微变黑，有腐败臭味。注：如实验室具备厌氧工作站等较好的厌氧培养条件，增菌培养基表层可不加液体石蜡。６．２．３　分离培养取增菌培养液划线接种血琼脂平板，３６℃±１℃厌氧培养４８ｈ。在此平板上破伤风梭菌呈白色或乳白色，中心紧密、周边疏松，直径１ｍｍ以上，菌落周围产生透明β型溶血环，呈迁徙性生长的特征菌落。６．２．４　革兰氏染色镜检取可疑菌落涂片、染色、镜检。破伤风梭菌为革兰氏阳性，营养期细菌呈细丝状，芽孢期细菌产生的芽孢圆形，位于菌体末端，直径比菌体宽大，似鼓槌状，其繁殖体为革兰氏阳性，带上芽孢的菌体有时转为革兰氏阴性。观察芽孢３７℃培养９６ｈ比较适宜，时间过短芽孢太小或是还没有完全形成，时间过长芽孢大部分会脱落。６．２．５　过氧化氢酶试验挑取固体培养基上可疑菌落于洁净载玻片上，滴加一滴３％过氧化氢（Ｈ２Ｏ２）溶液，于３０ｓ内产生２犛犖／犜２２０６．６—２０１０气泡者为阳性，不产生气泡者为阴性。破伤风梭菌呈阴性反应。６．２．６　增菌产毒培养根据菌落形态、染色镜检和生化特征挑取可疑菌落，接种庖肉培养基做增菌产毒培养，３６℃±１℃厌氧培养４８ｈ后进行毒力测定。６．２．７　毒力测定取上述增菌产毒培养液做毒力测定。６．２．７．１　实验动物选用昆明品系封闭群的清洁级（ＣＬ）或无特定病原菌级（ＳＰＦ）小白鼠（或其他品系的ＣＬ、ＳＰＦ级小白鼠），小白鼠饲养在通风、透光、清洁的室内环境，实验期间正常供给标准啮齿动物食物和饮水。６．２．７．２　选健康小白鼠１２只（体重１９ｇ～２１ｇ、雌雄各半），随机分成２群，１群注射供试品，一群为阳性对照。每群分为两组，分别做毒力试验（试验组）和破伤风抗毒素保护试验（保护组）。６．２．７．３　试验组中，小白鼠肌肉或皮下注射增菌培养液０．３ｍＬ～０．５ｍＬ，４ｈ后观察小鼠症状。破伤风外毒素引起的中毒症状为强直性痉挛，抽搐，呈现角弓反张，最后死亡。６．２．７．４　保护组中，为判断前述症状是否为破伤风外毒素所致，要进行破伤风抗毒素保护实验。在注射增菌培养液前先注射１２０Ｕ／ｍＬ破伤风抗毒素０．３ｍＬ～０．５ｍＬ，０．５ｈ后注射增菌培养液０．３ｍＬ～０．５ｍＬ，４ｈ后观察小鼠症状。６．２．８　结果判断６．２．８．１　阳性结果判断：如试验组小白鼠全部或部分出现破伤风外毒素引起的中毒症状而保护组小白鼠无上述症状时，毒力试验为阳性，可判定有破伤风梭菌存在。６．２．８．２　阴性结果判断：试验组小白鼠在注射１２０ｈ后全部没有出现破伤风外毒素引起的中毒症状，毒力试验为阴性，可判定没有破伤风梭菌存在。７　结果报告结果判定以小白鼠毒力实验为准，毒力试验阳性者，不论镜检是否检到破伤风梭菌，均按检出破伤风梭菌报告；若毒力试验阴性，则报告未检出。８　生物安全措施为保护实验室人员安全，所有培养物和废弃物应小心处置，按照ＧＢ１９４８９要求执行。犛犖／犜２２０６．６—２０１０书书书犛犖／犜２２０６．６—２０１０附　录　犃（规范性附录）培养基和试剂犃．１　生理盐水犃．１．１　成分氯化钠　　　　　　　　　　　８．５ｇ蒸馏水１０００ｍＬ犃．１．２　制法溶解后分装到锥形瓶中，每瓶９０ｍＬ，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ。犃．２　庖肉培养基犃．２．１　成分牛肉浸液１０００ｍＬ蛋白胨３０．０ｇ酵母膏５．０ｇ磷酸二氢钠５．０ｇ葡萄糖３．０ｇ可溶性淀粉２．０ｇ碎肉渣适量ｐＨ７．８犃．２．２　制法称取新鲜除脂肪和筋膜的碎牛肉５００ｇ，加蒸馏水１０００ｍＬ和１ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠溶液２５ｍＬ，搅拌煮沸１５ｍｉｎ，充分冷却，除去表层脂肪，澄清，过滤，加水补足至１０００ｍＬ。加入除碎肉渣外的各种成分，校正ｐＨ。碎肉渣经水洗后晾至半干分装１５０ｍｍ×１５０ｍｍ试管约２ｃｍ～３ｃｍ高，每管加入还原铁粉０．１ｇ～０．２ｇ或铁屑少许。将上述液体培养基分装至每管内超过肉渣表面约１ｃｍ，上面覆盖融化的凡士林或液体石蜡０．３ｃｍ～０．４ｃｍ。１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ。犃．３　血琼脂犃．３．１　成分ｐＨ７．４～７．６豆粉琼脂１００ｍＬ脱纤维羊血（或兔血）５ｍＬ～１０ｍＬ犃．３．２　制法加热溶化琼脂，冷至５０℃，以灭菌手续加入脱纤维羊血，摇匀，倾注平板。亦可用其他营养丰富的基础培养基配制血琼脂。０１０２—６６０２２犜／犖犛书号：１５５０６６·２２０６７９定价：　　１４．００元