SNT 2071-2008 亚洲柑桔黄龙病菌检疫鉴定方法

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２０７１—２００８亚洲柑桔黄龙病菌检疫鉴定方法犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犆犪狀犱犻犱犪狋狌狊犾犻犫犲狉狅犫犪犮狋犲狉犪狊犻犪狋犻犮狌犿２００８０４２９发布２００８１１０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前　　言　　本标准的附录Ａ为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中国检验检疫科学院动植物检疫实验所。本标准主要起草人：李今中、王念武、周卫川、朱水芳、林阳武。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２０７１—２００８亚洲柑桔黄龙病菌检疫鉴定方法１　范围本标准规定了进出境植物检疫中亚洲柑桔黄龙病菌的检疫和鉴定方法。本标准适用于进出境柑桔种子、苗木等寄主繁殖材料和柑桔水果类等植物产品中亚洲柑桔黄龙病菌的检疫和鉴定。２　原理２．１　亚洲柑桔黄龙病菌分类地位亚洲柑桔黄龙病菌（犆犪狀犱犻犱犪狋狌狊犾犻犫犲狉狅犫犪犮狋犲狉犪狊犻犪狋犻犮狌犿）属于薄壁菌门（Ｇｒａｃｉｌｉｃｕｔｅｓ）韧皮部杆菌属（犔犻犫犲狉狅犫犪犮狋犲狉）亚洲型细菌。相关资料参见附录Ａ。２．２　检疫鉴定原理利用多聚酶链式反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）技术，进行亚洲柑桔黄龙病的检疫鉴定。ＰＣＲ产物进行测序和ＢＬＡＳＴ，用于区分亚洲柑桔黄龙病菌和其他两种柑桔黄龙病菌。３　仪器３．１　研体。３．２　白瓷盘。３．３　ｐＨ计。３．４　ＰＣＲ管、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管（１．５ｍＬ）。３．５　移液枪（１０００μＬ可调、２００μＬ可调、２０μＬ可调、２．５μＬ可调）。３．６　恒温水浴锅或恒温培养箱。３．７　分析电子天平。３．８　低温冷冻超速离心机、低速离心机。３．９　ＰＣＲ扩增仪。３．１０　电泳仪。３．１１　凝胶成像仪。３．１２　低温冰箱。３．１３　高压灭菌锅。３．１４　超净工作台。４　试剂药品４．１　５０ｍｍｏｌ／Ｌ的ＴｒｉｓＨＣｌ。４．２　１０ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）。４．３　０．２ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠＋１％ＳＤＳ。４．４　０．５ｍＬ的乙酸钠（ｐＨ４．８）。４．５　液氮。４．６　无水乙醇、双蒸水（ＤＤＷ）。４．７　引物。４．８　１０×ＰＣＲ缓冲液、犜犪狇多聚酶。１犛犖／犜２０７１—２００８４．９　ｄＮＴＰ、Ｍａｒｋｅｒ。４．１０　１．２％琼脂凝胶、ＥＢ。４．１１　ＤＮＡ纯化试剂盒。５　亚洲柑桔黄龙病（犆犪狀犱犻犱犪狋狌狊犾犻犫犲狉狅犫犪犮狋犲狉犪狊犻犪狋犻犮狌犿）的检测和鉴定５．１　检验样品的准备症状检查：症状复杂，易与生理病害混淆，其典型症状为黄梢和斑驳。发病初期，病树部分新梢叶片不转绿而呈均匀黄化；叶片从主、侧脉附近或叶片基部边缘出现黄绿相同的斑驳，后期叶片均匀黄化、失去光泽，叶脉柄肿大，木栓化，硬脆而易脱落；果实小而呈畸形。检测样品：从待检样品中挑取有疑似症状的柑桔叶片叶脉约０．０５ｇ～０．１ｇ，用无菌水冲洗净。阳性对照：取感病的柑桔叶脉０．０５ｇ～０．１ｇ，用无菌水冲洗净。阴性对照：取健康的柑桔叶脉０．０５ｇ～０．１ｇ，用无菌水冲洗净。５．２　样品犇犖犃提取将准备好的样品和阳性对照样品各０．０５ｇ～０．１ｇ，剪碎后分置于研钵内，加液氮研磨成粉末，再加入５０ｍｍｏｌ／Ｌ的ＴｒｉｓＨＣｌ，１０ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）各０．４ｍＬ，１４０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，取上清液０．５ｍＬ，加入等体积０．２ｍｏｌ／Ｌ的氢氧化钠＋１％ＳＤＳ，摇匀，冰浴１０ｍｉｎ，再加入０．５ｍＬ的乙酸钠（ｐＨ４．８），摇匀，冰浴５ｍｉｎ，１４０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，取上清液０．５ｍＬ，加入１ｍＬ的无水乙醇，在－２０℃下放置２ｈ，１５０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，沉淀用７５％乙醇洗２次，吹干，灭菌双蒸水ＤＤＷ溶解。注：如果采用市场所售的植物总ＤＮＡ试剂盒提取，则按其公司提供的方法提取ＤＮＡ。５．３　犘犆犚扩增５．３．１　扩增引物上游引物Ｐ１：５′ＡＧＣＧＴＴＧＴＴＣＧＧＡＡＴＡＡＣＴＧＧ３′下游引物Ｐ２：５′ＡＣＣＴＴＣＣＴＣＣＧＧＣＴＴＡＴＣＡＣ３′ＰＣＲ预期产物ＤＮＡ片断长度为６５４ｂｐ。５．３．２　犘犆犚扩增用大约１．０μｇ～３．０μｇ的ＤＮＡ模板，１０×ＰＣＲ缓冲液、各成分的终浓度为：２００μｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ、１．２５～２．５Ｕ犜犪狇多聚酶、镁离子１ｍｍｏｌ／Ｌ～４ｍｍｏｌ／Ｌ、引物Ｐ１和引物Ｐ２各０．５μｍｏｌ／Ｌ～１μｍｏ１／Ｌ，反应体积为５０μＬ，混合后在ＰＣＲ仪上进行扩增，柑桔感病叶脉样品做阳性对照，健康叶脉样品做阴性对照，超纯水做空白对照。扩增程序为：９４℃变性５ｍｉｎ后，每一个ＰＣＲ循环温度、时间分别是９４℃、４５ｓ，５５℃、４５ｓ，７２℃、５０ｓ，进行３５个循环，７２℃延伸１０ｍｉｎ。注：反应体系的参数和扩增条件可根据自己购买的犜犪狇多聚酶设置。５．３．３　琼脂凝胶电泳用１．２％琼脂凝胶进行电泳，ＥＢ染色，凝胶成像系统观察、拍照。５．３．４　犘犆犚结果判定电泳成像结果，如果阳性对照样品和待测样品均出现大约６５４ｂｐ的预期条带，而阴性对照样品无预期条带，则判定检测结果为阳性；阳性对照样品出现预期条带而阴性对照和待测样品均无预期条带，则判定检测结果为阴性。５．４　犘犆犚扩增产物的测序和犅犔犃犛犜（局部相似性基本查询工具）５．４．１　犘犆犚扩增产物纯化ＰＣＲ合成产物用ＤＮＡ纯化试剂盒进行纯化，每一扩增产物（２５μＬ）加入１ｍＬＷａｓｈ溶液，以１５０００ｒ／ｍｉｎ速度离心３０ｓ后，在室温下孵育５ｍｉｎ，１５０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｓ，弃上清液，再加入１ｍＬＷａｓｈ溶液，重复１次前面的步骤，移去上清液后，风干蒸发残余的洗涤液，风干后加入２０μＬ无菌ＤＤＷ溶解。２犛犖／犜２０７１—２００８５．４．２　犘犆犚扩增产物测序将纯化的ＰＣＲ产物进行测序。５．４．３　犅犔犃犛犜同源性比较将扩增产物测序结果在ＧｅｎＢａｎｋ中进行ＢＬＡＳＴ比对，比较ＰＣＲ产物与三种柑桔黄龙病的同源性。５．４．４　犅犔犛犃犜结果判定如果扩增产物与亚洲柑桔黄龙病菌同源性达到９７％以上，则判定为亚洲柑桔黄龙病菌，否则判定不是亚洲柑桔黄龙病。６　结果评定ＰＣＲ反应结果为阳性，测序结果经ＢＬＡＳＴ后与亚洲柑桔黄龙病菌同源性达到９７％以上则判定为亚洲柑桔黄龙病菌；否则判定测试样品不含亚洲柑桔黄龙病菌。７　样品的保存和复核样品保存６个月，发现亚洲柑桔黄龙病的样品保存１年。柑桔种苗在隔离室盆栽保存，若为果实则保留经液氮干燥后的果蒂在－２０℃条件下保存，若是叶片同果实保存方法。检测的原始记录、照片、文档按有关规定做好登记、标识和存档，以备必要时复核。犛犖／犜２０７１—２００８书书书犛犖／犜２０７１—２００８附　录　犃（资料性附录）亚洲柑桔黄龙病菌简介亚洲柑桔黄龙病菌（犆犪狀犱犻犱犪狋狌狊犾犻犫犲狉狅犫犪犮狋犲狉犪狊犻犪狋犻犮狌犿）为薄壁菌门韧皮部杆菌属（犔犻犫犲狉狅犫犪犮狋犲狉）细菌，是一种无法人工纯培养杆菌。在电镜下看到其形态多为椭圆形或短杆状，大小为（３０ｎｍ～６００ｎｍ）×（５００ｎｍ～１４００ｎｍ），细胞壁厚度为２５ｎｍ～３０ｎｍ，革兰氏染色阴性，对四环素族抗菌素及青霉素敏感。病原可以通过嫁接或菟丝子（犆狌狊犮狌狋犪犮狅犿狆犲狊狋狉犻狊）传播，但不能通过汁液和土壤传播，自然传播介体为亚洲木虱（犇犻犪狆犺狅狉犻狀犪犮犻狋狉犻）。相似的病原细菌还有两个株系：即非洲型（犆犪狀犱犻犱犪狋狌狊犾犻犫犲狉狅犫犪犮狋犲狉犪犳狉犻犮犪狀狌犿），传播介体为非洲木虱（犜狉犻狅狕犪犪狉狔狋犲犪犲）以及最近在巴西发现的美洲型（犆犪狀犱犻犱犪狋狌狊犾犻犫犲狉狅犫犪犮狋犲狉犪犿犲狉犻犮犪狀狌犿）。亚洲柑桔黄龙病是柑桔上的一种毁灭性细菌病害，主要分布于非洲的毛里求斯、留尼旺岛（法属），亚洲的日本、印度、孟加拉国、巴基斯坦、泰国、越南、东南亚诸国，以及我国广东、香港、广西、福建、台湾、海南、云南、贵州、四川、浙江、湖南、江西等地。寄主植物主要有：桔橙、柠檬、柚、四季桔、桠柑、茶枝柑、甜橙等。该病被认为是世界上最危险的植物病害之一，严重威胁柑桔属水果生产。柑桔感染该病后，可致畸形、树势衰弱、果实苦涩。发病柑桔树一般在３年～５年内丧失结果能力，直至枯死，严重时甚至毁灭整个柑桔园。国际上许多国家和地区对该病实施检疫，我国已将该病列入新增的进境植物检疫危险性有害生物名单。症状检查：症状复杂，易与生理病害混淆。其典型症状为黄梢和斑驳。发病初期，病树部分新梢叶片不转绿而呈均匀黄化；叶片从主、侧脉附近或叶片基部边缘出现黄绿相同的斑驳，后期叶片均匀黄化、失去光泽，叶脉柄肿大，木栓化，硬脆而易脱落；果实小而呈畸形。８００２—１７０２犜／犖犛书号：１５５０６６·２１８９４２定价：　　６．００元