SNT 1559-2010 非洲猪瘟检疫技术规范

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１５５９—２０１０代替ＳＮ／Ｔ１５５９．１—２００５、ＳＮ／Ｔ１５５９．２—２００５、ＳＮ／Ｔ１５５９．３—２００５非洲猪瘟检疫技术规范犘狉狅狋狅犮狅犾狅犳狇狌犪狉犪狀狋犻狀犲犳狅狉犃犳狉犻犮犪狀狊狑犻狀犲犳犲狏犲狉２０１００３０２发布２０１００９１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布食品伙伴网书书书前　　言　　本标准代替ＳＮ／Ｔ１５５９．１—２００５《非洲猪瘟直接免疫荧光试验操作规程》、ＳＮ／Ｔ１５５９．２—２００５《非洲猪瘟间接免疫荧光试验操作规程》、ＳＮ／Ｔ１５５９．３—２００５《非洲猪瘟病毒红血球吸附试验操作规程》。本标准的附录Ｂ为规范性附录，附录Ａ、附录Ｃ、附录Ｄ和附录Ｅ为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国珠海出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。本标准主要起草人：罗宝正、潘文波、林祥梅、曾少灵、薄清如、吴绍强、徐海聂、杨素。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜１５５９—２０１０食品伙伴网非洲猪瘟检疫技术规范１　范围本标准规定了非洲猪瘟红细胞吸附试验、荧光抗体试验、聚合酶链式反应和犜犪狇ｍａｎ探针荧光ＰＣＲ、酶联免疫吸附试验、间接荧光抗体试验和免疫印迹试验的技术要求。本标准适用于非洲猪瘟的检疫。２　规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。ＧＢ１９４８９　实验室　生物安全通用要求３　缩略语下列缩略语适用于本标准。３．１ＡＳＦ：非洲猪瘟。３．２ＡＳＦＶ：非洲猪瘟病毒。３．３ＨＡＤ：红细胞吸附。３．４ＦＡＴ：荧光抗体试验。３．５ＰＣＲ：聚合酶炼反应。３．６ＥＬＩＳＡ：酶联免疫吸附试验。３．７ＩＦＡＴ：间接免疫荧光抗体试验。３．８ＭＥＭ：最低基础培养基。３．９ＰＢＳ：磷酸缓冲溶液。３．１０ＥＤＴＡ：乙二胺四乙酸。３．１１ＣＰＥ：细胞病变效应。３．１２ｄＮＴＰ：脱氧核糖三磷酸。１犛犖／犜１５５９—２０１０食品伙伴网３．１３ＤＮＡ：脱氧核糖核酸。３．１４Ｃｔ：循环阈值。３．１５ＦＩＴＣ：异硫氰酸荧光素。４　初步诊断参照附录Ａ中的临床症状和病理变化做出初步诊断，确诊还需实验室诊断。实验室诊断方法见第５章至第１１章。５　病毒红细胞吸附试验（犎犃犇）５．１　材料５．１．１　０．９％氯化钠：配制方法见附录Ｂ。５．１．２　０．０１ｍｏｌ／ＬｐＨ７．４ＰＢＳ：配制方法见附录Ｂ。５．１．３　青霉素、链霉素、庆大霉素和制霉菌素。使用前用上述ＰＢＳ分别配成１００００ＩＵ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、５００ＩＵ／ｍＬ和５００ＩＵ／ｍＬ的溶液。５．１．４　肝素：使用前用０．９％氯化钠配成１０００ＩＵ／ｍＬ。５．１．５　细胞基础培养液：配制方法见附录Ｂ。５．１．６　１％猪红血胞：配制方法见附录Ｂ。５．１．７　非洲猪瘟标准毒株。试验环境和防护要求见ＧＢ１９４８９，以下病毒操作的过程都按此要求。５．１．８　待检样品：包括肝素（或ＥＤＴＡ）抗凝血和脾脏、扁桃体、肾脏、淋巴结等组织。被检样品在运输过程中应尽可能的低温保存，但不能使样品冻结。样品到达实验室之后，如果不是立刻用于诊断，应该保存在－７０℃冰箱。５．２　操作方法５．２．１　制备组织悬液在放有灭菌砂子的研钵中，用组织研磨器或捣碎器将被检组织磨碎，加入５ｍＬ～１０ｍＬ含抗生素的ＰＢＳ（ｐＨ７．４），制成组织悬液（每毫升组织悬液的抗菌素含量为：青霉素１０００ＩＵ，链霉素１ｍｇ，庆大霉素５０ＩＵ和制霉菌素５０ＩＵ）。将组织悬液１０００犵离心５ｍｉｎ，取上清保存在４℃备用。５．２．２　制备白细胞采取健康猪血，用玻璃珠脱纤或用肝素抗凝（每毫升猪血含肝素１００ＩＵ），７００犵离心３０ｍｉｎ，将上层血清或血浆吸出备用。吸取中间淡黄色白细胞层，加三倍体积的０．８３％氯化铵溶液，混合后室温孵育１５ｍｉｎ，６５０犵离心１５ｍｉｎ，小心转移上清液，剩下的细胞沉淀用细胞基础培养液或ＰＢＳ洗涤３次，备用。５．２．３　制备细胞培养液将上述血清或血浆加入细胞基础培养液内配制成细胞培养液，血清或血浆的终浓度为１０％～３０％，同时加入抗生素。５．２．４　培养白细胞将白细胞悬浮于细胞培养液中，使细胞含量为１０６个／ｍＬ～１０７个／ｍＬ，分装于１６０ｍｍ×１６ｍｍ的管中，每管１．５ｍＬ，将试管与水平面呈５°～１０°倾斜放置，置于５％二氧化碳环境中，３７°培养２ｄ～４ｄ。这一过程也可以在９６孔培养板上进行，每孔加入２００μＬ白细胞培养液（１０６细胞／ｍＬ～１０７细胞／ｍＬ）。２犛犖／犜１５５９—２０１０食品伙伴网５．２．５　接种每份组织上清液接种３管／孔白细胞培养物，每管接种０．２ｍＬ或每孔加入２０μＬ。如果样品保存不好，做１０倍或１００倍稀释后再接种到培养物。用工作浓度的非洲猪瘟标准毒株接种１管白细胞培养物，作阳性对照。另留１管白细胞培养物不接种病毒，作阴性对照。５．２．６　加红细胞３７℃培养３ｄ后，每管加入０．２ｍＬＰＢＳ新鲜配制的１％猪红细胞，继续培养于３７℃。如果是９６孔培养板，培养１ｄ之后加２０μＬ新鲜配制的１％猪红细胞。５．２．７　镜检每天用显微镜或倒置显微镜检查细胞病变（ＣＰＥ）和红细胞吸附情况，连续检查７ｄ～１０ｄ。５．２．８　结果判定将培养物轻轻摇动，置于低倍镜下（１０×）观察。阳性对照的白细胞表面有大量猪红细胞附着，形成玫瑰花环或桑葚体状；而阴性对照的白细胞无红细胞附着，则对照成立，可进行结果判定。在无红细胞吸附的情况下发生的贴壁细胞数量减少的ＣＰＥ是由于接种物的细胞毒性引起，伪狂犬病或无血细胞吸附作用的ＡＳＦＶ可用细胞沉淀物做ＦＡＴ或用ＰＣＲ来检测。如果没有观察到变化，或ＦＡＴ和ＰＣＲ试验阴性，宜将上清液接种新鲜培养物再传３代。所有的分离培养物都应该用ＰＣＲ试验和测序确诊。６　病毒荧光抗体试验（犉犃犜）６．１　仪器设备６．１．１　冷冻切片机。６．１．２　恒温培养箱。６．１．３　荧光显微镜。６．１．４　冰箱。６．２　试验材料６．２．１　非洲猪瘟标准毒株。６．２．２　异硫氰酸荧光素标记的非洲猪瘟抗体。６．２．３　蒸馏水：用盐酸或氢氧化钠调整蒸馏水的ｐＨ值至７．４。６．２．４　０．０１ｍｏｌ／ＬｐＨ７．４ＰＢＳ（磷酸缓冲溶液），配制方法见附录Ｂ。６．２．５　丙酮：使用前置冰箱预冷。６．２．６　待检样品：无菌采取可疑病猪的脾脏、扁桃体、淋巴结，置于尽可能的低温但不冷冻的容器内运送和保存。待检样品也可以是已经接种的白细胞培养物。６．３　操作方法６．３．１　待检组织的制备６．３．１．１　组织切片、印片或涂片将待检组织制成厚度为４μｍ～７μｍ的冰冻切片，也可制成印片或涂片。６．３．１．２　白细胞培养物涂片用已接种待检组织的白细胞培养物涂片，制成待检标本。用阳性对照管的细胞培养物涂片，制成阳性对照标本。用阴性对照管的细胞培养物涂片，制成阴性对照标本。６．３．２　固定分别将上述标本在室温下自然风干，用预冷丙酮固定１０ｍｉｎ。６．３．３　加荧光抗体在标本上滴加预先滴定浓度的异硫氰酸荧光素标记的ＡＳＦＶ抗体染色，然后将标本放入湿盒内，置于３７℃恒温培养箱内着染１ｈ。阳性和阴性对照样品同时进行固定和染色。３犛犖／犜１５５９—２０１０食品伙伴网６．３．４　漂洗ＰＢＳ浸入洗涤４次。６．３．５　镜检标本上滴加１滴缓冲甘油，在带有适当光栅和滤光片的紫外光显微下观察。６．４　结果判定阴性对照的细胞无荧光产生，阳性对照出现特异性的粒状胞浆荧光，则对照成立，可进行结果判定。在淋巴组织的副皮质或其他组织固定的巨噬细胞内出现荧光的，判定为阳性；细胞浆内无荧光出现的，判定为阴性。７　犘犆犚试验７．１　试验仪器７．１．１　ＰＣＲ热循环仪。７．１．２　电泳仪。７．１．３　凝胶成像系统。７．２　主要试剂７．２．１　ＴＡＥ电泳缓冲液：配制方法见附录Ｂ；２％琼脂糖凝胶板：附配制方法见附录Ｂ。７．２．２　非洲猪瘟病毒毒株。７．２．３　引物：ｐｒｉｍｅｒ１（２０ｐｍｏｌ／μＬ）５’ＡＴＧＧＡＴＡＣＣＧＡＧＧＧＡＡＴＡＧＣ３’；ｐｒｉｍｅｒ２（２０ｐｍｏｌ／μＬ）５’ＣＴＴＡＣＣＧＡＴＧＡＡＡＡＴＧＡＴＡＣ３’。７．２．４　ＰＣＲ试剂：犜犪狇ＤＮＡ聚合酶、１．２５ｍｍｏｌ／Ｌ的ｄＮＴＰ（储存液浓度为２００ｍｍｏｌ／Ｌ，其中ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ和ｄＴＴＰ各５０ｍｍｏｌ／Ｌ，使用前在３６０μＬ蒸馏水中加入１０μＬ储存液即可）、１０×ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ（缓冲液）。商品化的ＰＣＲ试剂盒可以用来进行ＰＣＲ反应体系的制备。７．２．５　电泳加样缓冲液：３０％的甘油水溶液中加桔黄Ｇ到０．２５％。７．２．６　ＤＮＡ分子量标准：１００ｂｐ的商业化ＤＮＡ梯度标准。７．３　操作方法７．３．１　样品犇犖犃制备方法参见附录Ｃ。商品化的ＤＮＡ提取试剂盒可以用来进行模板ＤＮＡ的提取。７．３．２　犘犆犚反应体系配制７．３．２．１　ＰＣＲ反应体系在Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中配制，如果有狀个样品，同时配制狀＋２个反应体系，然后分装各管。每个反应管中包括下列成分：１．２５ｍｍｏｌ／Ｌ的ｄＮＴＰ８μＬ、１０×ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ５μＬ；氯化镁４μＬ（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）；犜犪狇ＤＮＡ聚合酶０．２５μＬ（５Ｕ／μＬ）；引物ｐｒｉｍｅｒｌ、ｐｒｉｍｅｒ２各１μＬ。含样品ＤＮＡ的组织上清液或阴性对照、阳性对照ＤＮＡ１０μＬ。无ＲＮＡａｓｅ或灭菌水补足到５０μＬ。商品化的荧光ＰＣＲ反应体系都可以使用，一定要保证两条引物的终浓度为０．４ｐｍｏｌ／μＬ。７．３．２．２　设定两个对照，阳性对照为２μＬ标准非洲猪瘟病毒毒株ＤＮＡ加８μＬ灭菌蒸馏水，阴性对照为不含ＤＮＡ的灭菌蒸馏水。７．３．３　犘犆犚反应的循环程序将加有样品上清液和对照混合物的Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管放入ＰＣＲ热循环仪中，按下列程序进行ＤＮＡ扩增：９４℃５ｍｉｎ；然后９４℃１ｍｉｎ，５０℃１ｍｉｎ，７２℃１ｍｉｎ３５个循环；最后７２℃１０ｍｉｎ。从ＰＣＲ热循环仪中取出之前，４℃保存。７．３．４　犘犆犚扩增产物的电泳检测反应结束后，从矿物油下取出各种反应混合物２０μＬ，放入另外一支干净的Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，并加入２μＬ加样缓冲液。将所有样品和阴性、阳性对照按编号加入到对应２％琼脂糖凝胶（用含溴化乙锭４犛犖／犜１５５９—２０１０食品伙伴网的ＴＡＥ溶液配制）中，在凝胶的合适位置加入标准分子量标准。将凝胶在１５０Ｖ恒定电压下电泳２ｈ，放在紫外光源下检查凝胶，用凝胶成像系统记录图像结果。７．４　结果判定紫外光源下观察凝胶或者记录的图像。阳性对照出现一条２７８ｂｐ的条带，阴性对照无任何条带。如果样品中出现和阳性对照大小一致条带，判为阳性；如果样品中没有出现２７８ｂｐ的特异性条带，判为阴性。８　病毒基因组犜犪狇犿犪狀探针荧光犘犆犚试验８．１　试验试剂和仪器８．１．１　样品ＤＮＡ制备方法同７．３．１。８．１．２　标准非洲猪瘟病毒毒株。８．１．３　引物ｐｒｉｍｅｒ３（５０ｐｍｏｌ／μＬ）５’ＣＴＧＣＴＣＡＴＧＧＴＡＴＣＡＡＴＣＴＴＡＴＣＧＡ３’，引物ｐｒｉｍｅｒ４（５０ｐｍｏｌ／μＬ）５’ＧＡＴＡＣＣＡＣＡＡＧＡＴＣ（Ａ／Ｇ）ＧＣＣＧＴ３’，探针ｐｒｏｂｅ５’ＣＣＡＣＧＧＧＡＧＧＡＡＴＡＣＣＡＡＣＣＣＡＧＴＧ３’（５ｐｍｏｌ／μＬ）。８．１．４　ＰＣＲ试剂：无菌水；荧光ＰＣＲ反应混合液（２×）。商品化的荧光ＰＣＲ试剂盒可以用来进行荧光ＰＣＲ反应体系的配制。８．１．５　荧光ＰＣＲ热循环仪。８．