SNT 1362-2011 假高粱检疫鉴定方法

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１３６２—２０１１代替ＳＮ／Ｔ１３６２—２００４假高粱检疫鉴定方法犕犲狋犺狅犱狊犳狅狉狇狌犪狉犪狀狋犻狀犲犪狀犱犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犛狅狉犵犺狌犿犺犪犾犲狆犲狀狊犲（犔．）犘犲狉狊２０１１０５３１发布２０１１１２０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准代替ＳＮ／Ｔ１３６２—２００４《假高粱检疫鉴定方法》。本标准与ＳＮ／Ｔ１３６２—２００４相比，主要技术变化如下：———规范了样品制备过程；———完善了原标准中鉴定方法与依据；———完善了原标准中结实小穗特征；———修改了原标准中仪器设备；———修改了原标准中结果判定；———修改了原标准中附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：邵秀玲、尼秀媚、宋涛、厉艳、甘琴华、吴兴海、纪瑛、王英超。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：———ＳＮ／Ｔ１３６２—２００４。Ⅰ犛犖／犜１３６２—２０１１假高粱检疫鉴定方法１　范围本标准规定了进出境植物及植物产品中假高粱的检疫与鉴定方法。本标准适用于进出境粮食、种子、芝麻、苗木等植物及其植物产品中混杂假高粱的分离与鉴定，还适用于进出境羊毛、皮张及运输工具等夹带的假高粱的鉴定。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＳＮ／Ｔ０８００．１　进出口粮油、饲料检验　抽样和制样方法３　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１小穗　狊狆犻犽犲犾犲狋构成禾本科植物复花序的基本单位，具一至多朵小花，每个小花外面包着外稃和内稃，内有雄蕊和雌蕊，每个小穗基部一般有两个颖片。３．２小穗轴　狉犪犮犺犻犾犾犪每个小穗有一短轴，其上着生一至多朵小花。３．３小花（带稃颖果）　犳犾狅狉犲狋禾本科的花（籽实）连同包被其外的内、外稃。３．４稃片　狊狇狌犪犿犪禾本科小穗上的小花，其外面具有两片苞片称为稃片，在外一片称为外稃（ｌｅｍｍａ），包着的内部一片称为内稃（ｐａｌｅａ）。３．５颖果　犮犪狉狔狅狆狊犻狊果皮与种皮愈合，不能分离。３．６颖片　犵犾狌犿犲禾本科植物小穗基部的苞片，第一颖（存在或退化）位置较低，亦称外颖（ｏｕｔｅｒｇｌｕｍｅ），第二颖位置较高，亦称内颖（ｉｎｔｅｒｇｌｕｍｅ）。３．７芒　犪狑狀禾本科小穗上的颖或外稃先端伸长成刚毛状物。１犛犖／犜１３６２—２０１１４　原理４．１　分类地位假高粱犛狅狉犵犺狌犿犺犪犾犲狆犲狀狊犲Ｌ．，隶属禾本科Ｇｒａｍｉｎｅａｅ，蜀黍属犛狅狉犵犺狌犿Ｍｏｅｎｃｈ。４．２　传播途径假高粱及其近似物种均以小穗、颖果的形式混杂于植物原粮、种子、芝麻、棉毛、苗木等植物及其植物产品之中，随货物调运而传播；假高粱还可通过人为及运输工具等夹带传播。４．３　鉴定依据本标准以假高粱的小穗、稃片、颖片、颖果的形态特征及其大小作为假高粱形态鉴定的依据；以假高粱染色体核型分析结果作为细胞学方法的鉴定依据；以假高粱及其近似种基因组中的特异序列和突变作为假高粱分子生物学方法的鉴定依据。５　仪器和用具５．１　仪器５．１．１　生物显微镜、染色体分析系统、体视显微镜（１０×～４０×）、扩大镜。５．１．２　核酸蛋白分析仪、纯水系统、ＰＧＲ超净工作台、ＰＣＲ仪、电泳仪、电泳槽、凝胶分析成像系统。５．１．３　电动筛和孔筛：电动筛规格旋转速率１００ｒ／ｍｉｎ～１５０ｒ／ｍｉｎ，孔筛一般采用圆筛，孔径分别为２．０ｍｍ、２．５ｍｍ、３．０ｍｍ、３．５ｍｍ、４．０ｍｍ。５．１．４　培养箱、水浴锅、电子秤（精度：千分之一）、冰箱、微波炉。５．２　用具５．２．１　白瓷盘：可采用多种规格的白瓷盘。５．２．２　解剖刀、解剖针、镊子、培养皿、指形管、广口瓶、双面胶。５．２．３　标本瓶、标签、原始记录纸、吸水纸、樟脑精、干燥剂。５．２．４　测微尺、直尺６　实验室检验６．１　样品制备将取回的混合样品充分混匀，采用四分法、点取法或用分样器进行分样，按照ＳＮ／Ｔ０８００．１制备平均样品，视样品多少，取平均样品的两分之一至四分之三作为检验样品。每份检验样品应不少于２ｋｇ；进口种子等样品可根据种类、数量等实际情况决定，送检样品不足１ｋｇ的全检。称取并记录检验样品的质量（精确到０．０１ｋｇ），剩余平均样品加贴标签作为保存样品保存。６．２　样品分离６．２．１　总则当送检样品的最窄处横径大于５ｍｍ时，可采用过筛检验法与人工挑选法，当送检样品最窄处横径小于５ｍｍ时，应采用人工挑选法。２犛犖／犜１３６２—２０１１６．２．２　过筛检验室内筛样检验时，至少采用双层筛子筛样。根据样品的直径大小确定套筛规格，从大到小依次套上不同孔径的规格筛和筛底，加入适量样品后盖上筛盖，以回旋法过筛，每筛旋转１５次～２０次（或用电动振筛机振荡），使样品充分分离后，将各层筛上物及筛下物分别倒入白磁盘内，挑选杂草籽入培养皿。６．２．３　人工挑选将少量检验样品倒入白磁盘内，以保证样品不相互覆盖。用镊子挑捡杂草籽，并放置于培养皿内。６．３　鉴定方法６．３．１　总则对成熟且外部形态特征典型的种子可通过形态鉴定进行结果判定，对成熟度不够、种子受损等形态鉴定无法准确判定的疑似种应通过细胞学方法、分子生物学方法进一步确证。６．３．２　镜检形态鉴定用肉眼或借助放大镜对杂草籽进行分类，将疑似蜀黍属小穗、带稃颖果、颖果等挑选出来，于体视显微镜下进一步观察。在体视显微镜下，观察其小穗、小穗轴、稃片、颖果的外部形态特征。对外部形态判断模糊的，可用解剖刀及解剖针对种子进行解剖，观察其种脐、种胚的形状及大小等特征。假高粱形态特征见附录Ａ，近似种的形态比较见附录Ｂ、附录Ｃ。６．３．３　细胞学方法将可疑种子萌发培养，制作染色体玻片镜检观察，并进行核型分析。具体实验步骤见附录Ｄ。６．３．４　分子生物学方法（犔犃犘犆犚方法）将可疑种子的颖果用液氮研磨，利用基因组提取试剂盒提取植物基因组ＤＮＡ。利用ＬＡＰＣＲ法对犃犱犺１基因进行扩增，条带大小约为２０００ｂｐ，并将ＰＣＲ产物测序。具体实验步骤见附录Ｅ，假高粱及其近似种的ＧｅｎＢａｎｋ登录号参见附录Ｆ。７　结果判定７．１　形态学方法以成熟小穗的形态特征为依据，符合附录Ａ者可通过形态鉴定直接判定为假高粱，否则结果判定为阴性。７．２　细胞学方法根据样品的核型公式及核型类型，与表Ｄ．４中假高粱的核型相符的样品判定为阳性，否则为阴性。７．３　分子生物学ＬＡＰＣＲ方法的结果判定以测序结果与Ｇｅｎｂａｎｋ比对核酸同源值为准，同源值最高且同源性高于９９．５％者结果判定为阳性，否则结果为阴性。３犛犖／犜１３６２—２０１１８　综合判定根据不同的鉴定方法分别对检测结果进行最终判定。形态鉴定结果为阳性的样品可最终判定为阳性；形态鉴定可疑，分子生物学或细胞学结果有一项为阳性的样品可最终判定为阳性；否则结果判定为阴性。９　有害生物含量计算经鉴定为检疫性有害生物的应按式（１）计算杂草含量：有害生物含量（粒／ｋｇ）＝狆／犿………………………………（１）　　式中：狆———试样中有害生物的数量，单位为粒；犿———试样质量，单位为千克（ｋｇ）。１０　样品保存鉴定完毕后，将鉴定出的假高粱种子装入种子（样品）瓶等容器内，并加以明确标识；发现假高粱的样品由经手人标识确认、样品管理员登记，置放于恒温、恒湿、防鼠处至少保存６个月，以备复验、谈判、仲裁，作为对外交涉之依据，保存期满，经灭生后妥善处理。４犛犖／犜１３６２—２０１１附　录　犃（规范性附录）假高粱形态鉴定特征犃．１　蜀黍属特征蜀黍属别名高粱属，其主要形态特征：小穗孪生，但在穗轴顶端之一节则为三枚共生。有柄小穗为雄性或中性，常退化而不孕；无柄小穗为两性结实，背腹压扁，基盘短而钝圆，第一颖下部呈革质，平滑而有光泽。小穗通常有明显的芒，芒自第二外稃顶端二裂齿间伸出，芒膝曲扭转，极易脱落，第二颖背面有二枚小穗轴，顶端有关节或不明显。犃．２　假高粱形态特征犃．２．１　结实小穗特征小穗孪生，顶为３枚共生。结实的无柄小穗卵状披针形或椭圆形，背腹扁，腹面具穗轴节间和有柄小穗柄各１枚；无柄小穗长３．５ｍｍ～５．０ｍｍ，宽１．８ｍｍ～２．０ｍｍ，厚约为１．５ｍｍ，黄褐色、红褐色至紫黑色，表面光滑，有光泽。第一颖革质，具油漆光泽，上部具２脊，脊和边缘有纤毛（早落）；第二颖中央脊突，无毛，成舟形。两颖片革质，顶端常呈破碎状，基部圆。小穗轴顶端有关节，小穗系由关节处整齐脱落。稃片白膜质透明，芒由第二外稃裂齿间伸出，膝曲扭转，长约１２ｍｍ，极易断落，有时无芒。杂交种丝克高粱（犛．狊犻犾犽）主要来源于澳大利亚，与假高粱在形态上很相似，主要区别为：原始种的丝克高粱较假高粱略窄，小穗轴不易脱落。但该种变异较大，如遇可疑者需通过分子生物学方法进一步确认。犃．２．２　颖果特征颖果长２．６ｍｍ～３．２ｍｍ，宽１．５ｍｍ～１．８ｍｍ，厚约１．０ｍｍ；倒卵形或椭圆形，暗红褐色或棕色，表面乌暗而无光泽；侧面观，背面钝圆，腹面扁平，全长近等厚；先端钝圆，具宿存花柱２枚；基部钝尖。种脐微小，圆形，深褐色。犃．２．３　解剖特征稃片薄膜质，透明，稍短于小穗，第二外稃先端二裂，芒从裂齿间伸出，膝曲扭转，芒长９ｍｍ～１５ｍｍ，常折断；胚卵圆形或椭圆形，长为颖果的二分之一至三分之二。５犛犖／犜１３６２—２０１１书书书附　录　犅（规范性附录）假高粱与其近似种的比较表犅．１　假高粱与其近似种的比较种类假高粱黑高粱苏丹草光高粱拟高粱学名　犛狅狉犵犺狌犿犺犪犾犲狆犲狀狊犲（Ｌ．）Ｐｅｒｓ．　犛狅狉犵犺狌犿犪犾犿狌犿Ｐａｒｏｄｉ　犛狅狉犵犺狌犿狊狌犱犪狀犲狀狊犲（Ｐｉｐｅｒ）Ｓｔａｐｆ．　犛狅狉犵犺狌犿狀犻狋犻犱狌犿（Ｖａｈｌ．）Ｐｅｒｓ．　犛狅狉犵犺狌犿狆狉狅狆犻狀狇狌狌犿（Ｋｕｎｔｈ．）Ｈｉｔｃｈｅ无柄小穗　长３．５ｍｍ～５．０ｍｍ，顶端稍钝形，无芒或有芒，卵状披针形　长５．０ｍｍ～５．５ｍｍ，宽２．３ｍｍ～２．５ｍｍ，厚约１．８ｍｍ，小穗轴有或无关节，成熟小穗轴折断而分离，折断处不整齐　长５．５ｍｍ～６．５ｍｍ，顶端稍尖，阔椭圆形，芒易脱落，有柄小穗呈披针形　长３．０ｍｍ～５．０ｍｍ，顶端稍钝形，卵状披针形，芒长可达２０ｍｍ，可脱落　长２．５ｍｍ～５．０ｍｍ，顶端突然尖锐，具短小尖头，无芒，菱状披针形颖片　革质，呈黄褐色、红褐色或紫黑色，有光泽，先端锐尖　革质，呈黄褐色、红褐色或紫黑色，有光泽，先端锐尖　革质，有光泽，呈黄褐色、红褐色至紫黑色　革质，黑色　革质，下部红褐色，上部或顶端黄色第１颖　背部近扁平，具二脊，脊和边缘上具短纤毛　背部近扁平，具二脊，脊和边缘上具短纤毛　颖具二脊，脊上有短纤毛　第一颖脉不明显，顶钝或平，上部和边缘密生褐色柔毛　扁平，顶端无齿或齿不显著，脉不明显，边缘包第二颖，二侧脊及背部密被纤毛第２颖　具一脊，舟形，脊上有短纤毛　具一脊，舟形，脊上有短纤毛　具一脊，脊近顶端有纤毛　顶端具短尖，具三至五条纵脉，背部微隆起　中脊突出，基部穗轴节间和小穗柄各一枚，顶端膨大内陷具白色长柔毛第１小花　仅有外稃，膜质，具三脉，长圆状披针形　仅有外稃，膜质，具三脉，长圆状披针形　内、外稃均膜质透明　仅有外稃，厚膜质，卵状披针形　仅有外稃，膜质，具一脉，三角状披针形６犛犖／犜１３６２—２０１１书书书表犅．１（续）种类假高粱黑高粱苏丹草光高粱拟高粱第２小花　膜质的内外稃边缘被毛；外稃三角状披针形，长约２．０ｍｍ，顶端微二裂，主脉由齿间伸出芒，芒长约３．５ｍｍ，有时呈小尖头而无芒；内稃线形或不规则　外稃三角状披针形，顶端微二裂，主脉由齿间伸出芒，有时无芒；内稃线形或不规则　内外稃膜质；外稃先端二裂，芒从齿裂中间伸出，芒长８．５ｍｍ～１２ｍｍ　外稃宽披针形，透明膜质，边缘被毛，顶端二齿裂，芒自齿间伸出，膝曲扭转，芒长可达２０ｍｍ以上　膜质的内外稃边缘被毛；外稃披针形，长３．５ｍｍ，顶端无芒；内稃线形颖果　颖