SB-T 10317-1999 蛋白酶活力测定法

中华人民共和国专业标准蛋白酶活力测定法SB/T10317-1999Measurementofproteinaseactivity━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━本方法适用于酿造酱油时在制品菌种、成曲的蛋白酶活力测定。1福林法1.1试剂及溶液:以下试剂都为分析纯1.1.1福林试剂(Folin试剂):于2000mL磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g,钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g,蒸馏水700mL,85%磷酸50mL,浓盐酸100mL,文火回流10h。取去冷凝器,加入硫酸锂(Li2SO4)50g,蒸馏水50mL,混匀,加入几滴液体溴,再煮沸15min,以驱逐残溴及除去颜色,溶液应呈黄色而非绿色。若溶液仍有绿色,需要再加几滴溴液,再煮沸除去之。冷却后,定容至1000mL,用细菌漏斗(No4～5)过滤,置于棕色瓶中保存。此溶液使用时加2倍蒸馏水稀释。即成已稀释的福林试剂。1.1.20.4mol碳酸钠溶液:称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4g,定容至1000mL。1.1.30.4mol三氯乙酸(TCA)溶液:称取三氯乙酸(CCL3COOH)65.4g,定容至1000mL。1.1.4pH7.2磷酸盐缓冲液:称取磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)31.2g,定容至1000mL,即成0.2mol溶液(A液)。称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)71.63g,定容至1000mL,即成0.2mol溶液(B液)。取A液28mL和B液72mL,再用蒸馏水稀释1倍,即成0.1molpH7.2的磷酸盐缓冲液。1.1.52%酪蛋白溶液:准确称取干酪素2g,称准至0.002g,加入0.1N氢氧化钠10mL,在水浴中加热使溶解(必要时用小火加热煮沸),然后用pH7.2磷酸盐缓冲液定容至100mL即成。配制后应及时使用或放入冰箱内保存,否则极易繁殖细菌,引起变质。1.1.6100μg/mL酪氨酸溶液:精确称取在105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000g,逐步加入6mL1N盐酸使溶解,用0.2N盐酸定容至100mL,其浓度为1000μg/mL,再吸取此液10mL,以0.2N盐酸定容至100mL,即配成100μg/mL的酪氨酸溶液。此溶液配成后也应及时使用或放入冰箱内保存,以免繁殖细菌而变质。1.2仪器a.分析天平:感量0.1mg;b.581-G型光电比色计或72型分光光度计;c.水浴锅;d.1、2、5、10mL移液管等。1.3操作1.3.1标准曲线的绘制1.3.1.1按下表配制各种不同浓度的酪氨酸溶液(表1)。表1配制各种不同浓度的酪氨酸溶液━━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━━━┃管号试剂┣━━┳━━┳━━┳━━┳━━┳━━━┃1┃2┃3┃4┃5┃6━━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━蒸馏水,mL┃10┃8┃6┃4┃2┃0100μg/mL酪氨酸,mL┃0┃2┃4┃6┃8┃10酪氨酸最终浓度,μg/ml┃0┃20┃40┃60┃80┃100━━━━━━━━━━━┻━━┻━━┻━━┻━━┻━━┻━━━1.3.1.2测定步骤:取6支试管编号按表1分别吸取不同浓度酪氨酸1mL,各加入0.4mol碳酸钠5mL,再各加入已稀释的福林试剂1mL。摇匀置于水浴锅中。40℃保温发色20min在581-G型光电比色计上分别测定光密度(OD)(滤色片用65**#)或用72型分光光度计进行测定(波长660nm)。一般测三次,取平均值。将1～6号管所测得的光密度(OD)减去1号管(蒸馏水空白试验)所测得的光密度为净OD数。为了清楚起见。再列出表格如下(表2)。表2━━━━━━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━━━┃管号试剂┣━━┳━━┳━━┳━━┳━━┳━━━┃1┃2┃3┃4┃5┃6━━━━━━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━按表1制备的不同浓度酪氨酸,mL┃1┃1┃1┃1┃1┃1━━━━━━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━0.4mol/LNa2CO3,mL┃5┃5┃5┃5┃5┃5━━━━━━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━福林试剂,mL┃1┃1┃1┃1┃1┃1━━━━━━━━━━┳━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━┃1┃┃┃┃┃┃┣━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━┃2┃┃┃┃┃┃OD值┣━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━┃3┃┃┃┃┃┃┣━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━┃平均┃┃┃┃┃┃━━━━━━━━━━┻━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━净OD值┃0┃┃┃┃┃━━━━━━━━━━━━━━━┻━━┻━━┻━━┻━━┻━━┻━━━以净OD值为横坐标,酪氨酸的浓度为纵坐标,绘制成标准曲线(或可求出每度OD所相当的酪氨酸量K)。1.3.2样品稀释液的制备。1.3.2.1测定酶制剂:称取酶粉0.100g,加入pH7.2磷酸盐缓冲液定容至100mL,吸取此液5mL,再用缓冲液稀释至25mL,即成5000倍的酶粉稀释液。1.3.2.2测定成曲酶:称取充分研细的成曲5g,加水至100mL,在40℃水浴内间断搅拌1h,过滤,滤液用0.1molpH7.2磷酸盐缓冲液稀释到一定倍数(估计酶活力而定)。1.3.3样品测定:取15×100mm试管3支,编号1、2、3(做2只也可),每管内加入样品稀释液1mL,置于40℃水浴中预热2min,再各加入经同样预热的酪蛋白1mL,精确保温10min,时间到后,立即再各加入0.4mol三氯乙酸2mL,以终止反应,继续置于水浴中保温20min,使残余蛋白质沉淀后离心或过滤,然后另取15×150mm试管3支,编号1、2、3,每管内加入滤液1mL,再加0.4mol碳酸钠5mL,已稀释的福林试剂1mL,摇匀,40℃保温发色20min后进行光密度(OD)测定。空白试验也取试管3支,编号(1)、(2)、(3),测定方法同上,唯在加酪蛋白之前先加0.4mol三氯乙酸2mL,使酶失活,再加入酪蛋白。为了清楚起见,分别列出表格于下(见表3及表4)。表3━━━━━━━━━━┳━━━━━┳━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━┃管号┃试剂┃管号试剂┣━┳━┳━┫┣━━┳━━┳━━┃1┃2┃3┃┃(1)┃(2)┃(3)━━━━━━━━━━╋━╋━╋━╋━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━预热酶液,mL┃1┃1┃1┃预热酶液,mL┃1┃1┃1━━━━━━━━━━╋━╋━╋━╋━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━预热2%酪蛋白,mL┃1┃1┃1┃0.4mol三氯乙酸,mL┃2┃2┃2━━━━━━━━━━┻━┻━┻━╋━━━━━━━━━━╋━━╋━━┻━━作用10min(精确计时)┃作用10min(精确计时)┃┃━━━━━━━━━━┳━┳━┳━╋━━━━━━━━━━╋━━╋━━┳━━0.4mol三氯乙酸,mL┃2┃2┃2┃预热2%酪蛋白,mL┃1┃1┃1━━━━━━━━━━┻━┻━┻━┻━━━━━━━━━━┻━━┻━━┻━━表4━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━┃管号试剂┣━┳━┳━━┳━━┳━━┳━━━┃1┃2┃3┃(1)┃(2)┃(3)━━━━━━━━━━╋━╋━╋━━╋━━╋━━╋━━━滤液,mL┃1┃1┃1┃1┃1┃1━━━━━━━━━━╋━╋━╋━━╋━━╋━━╋━━━0.4molNa2CO3,mL┃5┃5┃5┃5┃5┃5━━━━━━━━━━╋━╋━╋━━╋━━╋━━╋━━━福林试剂,mL┃1┃1┃1┃1┃1┃1━━━━━━━━━━╋━╋━╋━━╋━━╋━━╋━━━OD值┃┃┃┃┃┃━━━━━━━━━━╋━┻━┻━━╋━━┻━━┻━━━平均OD值┃┃━━━━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━净OD值┃┃0━━━━━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━━━━样品的平均光密度(OD)一空白的平均光密度(OD)=净OD值。1.4计算在40℃下每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸,定义为1个蛋白酶活力单位。A1样品蛋白酶活力单位(干基)=━━×4×N×━━━………………………(1)101-W式中:A——由样品测得OD值,查标准曲线得相当的酪氨酸微克数(或OD值×K);4——4毫升反应液取出1mL测定(即4倍);N——酶液稀释的倍数;10——反应10min;W——样品水分百分含量。1.5注意事项以上介绍的方法用于测定中性蛋白酶(pH7.2)。若要测定酸性蛋白酶或碱性蛋白酶,则把配制酪蛋白溶液和稀释酶液用的pH缓冲液换成相应pH缓冲液即可。现把几种常用pH缓冲液配方提供如下:1.5.1pH7.5磷酸盐缓冲液(0.02mol/L)称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)6.02g和磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)0.5g以蒸馏水溶解定容至1000mL。1.5.2pH2.5乳酸-乳酸钠缓冲液(0.05mol)A液:称取80%～90%乳酸10.6g,加蒸馏水稀释定容至1000mL。B液:称取70%乳酸钠16g,加水稀释定容至1000mL。取A液16mL与B液1mL混合稀释一倍即成。1.5.3pH3.0乳酸-乳酸钠缓冲液(0.05mol)A液:称取80%～90%乳酸10.6g,以水定容至1000mL。B液:称取70%乳酸钠16g,蒸馏水溶解定容至1000mL。取A液8mL与B液1mL,混合稀释一倍即成。1.5.4pH10硼砂-氢氧化钠缓冲液A液:称取硼砂19.08g,用蒸馏水溶解定容至1000mL(0.05mol)。B液:称取氢氧化钠8g,用蒸馏水溶解定容至1000mL(0.2N)。取A液250mL,B液215mL混合,用蒸馏水稀释定容至1000mL即成。1.5.5pH11.0硼砂-氢氧化钠缓冲液A液:称取硼砂19.08g,用蒸馏水定容至1000mL。B液:称取氢氧化钠4g,用蒸馏水定容至1000mL。取A液与B液等量混合。1.5.62%酪蛋白溶液配成酸性时,须先加数滴浓乳酸,使之湿润以加速其溶解。2甲醛法成曲蛋白酶活力的测定,如用福林法测定确有困难时,可用甲醛法测定作过渡。2.1仪器a.分析天平:感量0.01g;b.水浴锅;c.电烘箱;d.容量瓶、吸管、滴定管等。2.2试剂与溶液a.1%酚酞指示剂;b.0.1%麝香草酚蓝;c.0.1N氢氧化钠液、甲醛(试剂配制法同氨基态氮的测定,见ZBX66038—87《氨基态氮测定法》)。2.3操作2.3.1目测法称取研细均匀的成曲样品10g,放入250mL锥形瓶中,加55℃温水80mL,充分摇匀,置于55℃水浴锅中保温3h,取出后加热煮沸以破坏酶活力,冷却后定容至100mL,充分摇匀后以脱脂棉过滤,吸取滤液10mL,移至150mL锥形瓶中,加水50mL,1%酚酞指示剂0.2mL,以0.1N氢氧化钠标准溶液滴定至刚显微红色(pH8.2),记下滴定数作为总酸,继续加甲醛10mL,用0.1N氢氧化钠液滴定至深红色(pH8.5)为终点,若再加麝香草酚蓝1mL作指示剂,则滴至紫红色为终点。记下滴定数,减去空白数后计算成氨基态氮。另称取曲10g做水分,再折算成干基数。2.3.2酸度计法所用仪器、药品、操作方法等与氨基态氮测定法同(见ZBX66038-87)。2.4计算蛋白酶活力(克氨基态氮/100g)(干基)(V-***Vo)×N×0.014100=━━━━━━━━━━×━━━………………………………(2)101-W10×━━━100式中:V——加入甲醛后氢氧化钠标准液滴定数,mL;***Vo——甲醛空白滴定数,mL;W——曲水分,%;N——氢氧化钠标准溶液的当量数,N;0.014——氮的毫克当量数。━━━━━━━━━附加说明:本标准由商业部副食品局提出。本标准由上海市酿造科学研究所起草。本标准主要起草人须凤高。━━━━━━━━━*本法实质上是在一定温度下、一定时间内,成曲利用自身的蛋白酶把自身原料中的蛋白质水解成氨基酸。以测定