DBS13 003-2015 食品安全地方标准 阪崎肠杆菌和沙门氏菌检测

2015-04-23发布2015-05-01实施DBS13河北省地方标准DBS13/003—2015食品安全地方标准阪崎肠杆菌和沙门氏菌检测河北省卫生和计划生育委员会发布DBS13/003—2015I前   言本标准按GB/T1.1-2009规定的格式编写。本标准由河北省卫生和计划生育委员会归口。本标准于2015年4月23日首次发布。DBS13/003—20151食品安全地方标准阪崎肠杆菌和沙门氏菌检测1范围本标准适用于应用实时荧光定量PCR法定性检测阪崎肠杆菌和沙门氏菌。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4789.4食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验。GB4789.40食品安全国家标准食品微生物学检验阪崎肠杆菌检验。3方法提要阪崎肠杆菌和沙门氏菌均属于肠杆菌科，本检测方法首先对肠杆菌科和阪崎肠杆菌进行同步检测。当肠杆菌科为阴性时可直接报告沙门氏菌阴性；当肠杆菌科为阳性时再进行沙门氏菌的检测；当阪崎肠杆菌为阳性时需按照GB4789.40进行确证；当沙门氏菌为阳性时需按照GB4789.4进行确证。4设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：4.1二级生物安全柜4.2磁力搅拌器：0-2400r/min。4.3卤素灯：500W。4.4低温离心管架：1.5mL，0℃。4.5水浴锅或金属恒温加热器：5℃-100℃。4.6漩涡振荡器。4.7离心机：12000r/min。4.8移液器及对应吸头：10μL、100μL、200μL、1000μL。4.9超净工作台。4.10实时荧光定量PCR仪（含有FAM-,HEX-和ROX-检测通道）。4.11冰箱：2℃—8℃和-20℃两种。DBS13/003—201524.12天平：感量0.1g。4.130.2mL8联排管以及8联排帽（与PCR仪配套使用）。4.141.5mL无菌透明离心管。4.15恒温培养箱：25℃±1℃，36℃±1℃，44℃±0.5℃。4.16无菌锥形瓶：容量100mL、200mL、2000mL。5培养基和试剂除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯。5.1缓冲蛋白胨水（BPW）：见附录A.1。5.2营养肉汤培养基（NB）：见附录A.2。5.3125µg/mL溴化乙锭单叠氮溴溶液（EMA）：见附录A.3。5.4DNA提取缓冲液:0.1%Chelex100（螯合树脂）水溶液。5.5吐温80。5.6按照表1和表4的序列合成的引物和标记的探针。5.7TaqDNA聚合酶：5U/µL。5.8TaqPCR缓冲液。5.950mmol/LMgCl2溶液：见附录A.4。5.10dNTPs（dATP,dUTP,dCTP,dGTP），浓度均为10mmol/L。5.11尿嘧啶-N-糖基化酶：1U/µL。5.12pUC19质粒DNA，200拷贝/µL。5.13阪崎肠杆菌质控菌株：ATCC29544，或等效菌株。5.14沙门氏菌质控菌株：ATCC13311，或等效菌株。5.15大肠杆菌质控菌株：ATCC10536，或等效菌株。5.16金黄色葡萄球菌：CICC10301，或其它非肠杆菌科的阴性质控等效菌株。6检验程序检验程序见图1。DBS13/003—2015336℃1℃，16h-20h图1检验程序7操作步骤7.1首次增菌称取样品100g（mL）加入到900mL预热至37℃的BPW中，充分混匀，36℃1℃培养16h–20h。对于含有超过20%脂肪含量的样品，需要在BPW中加入1g/L（每10%脂肪含量）的吐温80。7.2二次增菌充分摇匀首次增菌液，吸取50µL转种于450µL预热至37℃的BPW中，36℃1℃培养3h–4h。7.3样品模板DNA的制备7.3.1吸取100µL二次增菌液加入到1.5mL无菌透明离心管中；加入400µLEMA溶液，室温下暗室培养5min。7.3.2将离心管放入低温离心管架中，置于500W卤素灯正下方，相距15cm-20cm，曝光5min后，10000r/min离心5min。7.3.3用移液器移除上清液，加入200µLDNA提取缓冲液，充分混匀后，置于95℃-100℃水浴锅或金属恒温加热器中维持10min。7.3.4室温下静置1min，振荡混匀，12000r/min离心2min，上清液即为DNA模板。7.4质控菌株模板DNA的制备检样100g（mL）加入到900mLBPW中进行首次增菌50µL首次增菌样品加入到450µLBPW中进行二次增菌36℃1℃，3h-4h100µL二次增菌样品加入到EMA溶液中（灭活死亡细胞的DNA）DNA的提取实时荧光定量PCR检测阴性结果报告阳性GB4789.40、GB4789.4进行确证DBS13/003—20154分别接种供试的阳性对照菌株（大肠杆菌、阪崎肠杆菌、沙门氏菌）和阴性对照菌株（金黄色葡萄球菌）到10mLNB培养液中，36℃1℃培养过夜，各取1.5mL增菌液，同上离心、提取DNA模板。7.5PCR反应所用引物和探针工作液的配制根据表1反应体系中每种引物和探针的终浓度，使用灭菌去离子水配制含有6种目标基因引物的工作液（浓度分别为10µmol/L）和含有3种探针的工作液（浓度分别为10µmol/L）。表1目标基因引物和探针序列及每个反应体系内的终浓度引物和探针名称序列终浓度（µmol/L）肠杆菌科-F5´-CTGAAAGCATCTAAGCACGAAACTTG-3´0.4肠杆菌科-R5´-GTCGTCTTCAACGTTCCTTCAGG-3´0.4阪崎肠杆菌-F5´-AGGGGATATTGTCCCCTGAAACAG-3´0.4阪崎肠杆菌-R5´-AAACGAGAATAAGCCGCGCATT-3´0.4内部扩增对照（IAC）-F5´-TGTGAAATACCGCACAGATG-3´0.4内部扩增对照（IAC）-R5´-AGCTGGCGTAATAGCGAAG-3´0.4肠杆菌科探针5´-FAM-CCCGAGATGAGTTCTCCCTGASMCTTTAAGT-BHQ-1-3´0.2阪崎肠杆菌探针5´-HEX-AGAGTAGTAGTTGTAGAGGCCGTGCTTCCGAAAG-BHQ-1-3´0.2IAC探针5´-ROX-TAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCC-BHQ-2-3´0.27.6模板DNA荧光PCR反应体系的配制每个样品按照表2的加液量配制25µL反应体系。表2目标基因扩增体系配制表试剂名称加样体积（µL）灭菌去离子水12.110×TaqPCR反应缓冲液2.550mmol/LMgCl22.010mmol/LdNTPs0.5引物工作液1.0探针工作液0.55U/µLTaqDNA聚合酶0.151U/µL尿嘧啶-N-糖基化酶0.25200拷贝/µLpUC19质粒DNA1.0DNA模板5.0总体积25每次进行PCR反应均需使用pUC19质粒DNA作为内部扩增对照，并设置阳性、阴性和空白对照（灭菌去离子水）。7.7肠杆菌科和阪崎肠杆菌实时荧光定量PCR检测将配制完成的反应管放入实时荧光定量PCR仪中，按照如下步骤设置反应条件：反应步骤一：预变性，37℃4min，95℃5min，1个循环；DBS13/003—20155反应步骤二：扩增和信号收集，95℃变性10s，65℃退火和延伸（每个循环降低0.1℃）70s，40个循环，同时收集FAM，HEX和ROX的荧光信号。核查反应条件正确后，启动反应程序。7.8结果判读当检测样本Ct值小于或等于35时，报告为阳性；Ct值大于35且小于40时，需要重复一次，如果Ct值仍小于40，且曲线有明显的对数增长期，报告为阳性，否则为阴性；样本没有Ct值时，报告为阴性。具体结果判定参照表3。表3肠杆菌科和阪崎肠杆菌结果判读表肠杆菌科FAM阪崎肠杆菌HEX内部扩增对照（IAC）ROX结果判读阳性阳性阳性或阴性肠杆菌科及阪崎肠杆菌阳性，可能含有沙门氏菌阳性阴性阳性或阴性肠杆菌科阳性，阪崎肠杆菌阴性，可能含有沙门氏菌阴性阴性阳性肠杆菌科、阪崎肠杆菌及沙门氏菌阴性阴性阴性阴性无效的结果当FAM通道为阳性，HEX通道为阳性时，可报告肠杆菌科和阪崎肠杆菌阳性；当FAM通道为阳性，HEX通道为阴性时，可报告肠杆菌科阳性但阪崎肠杆菌阴性；当FAM通道为阴性，HEX通道为阴性，ROX通道为阳性时，可报告肠杆菌科和阪崎肠杆菌阴性；当FAM通道，HEX通道和ROX通道均为阴性时，为无效的结果应重做实验。当肠杆菌科和阪崎肠杆菌均为阴性时，可报告沙门氏菌阴性；当肠杆菌科为阳性时，需要按下一步骤进一步单独确证样本中是否含有沙门氏菌。7.9沙门氏菌的确证实验DNA模板可直接采用7.3已制备的样品DNA模板。7.9.1PCR反应所用引物和探针工作液的配制根据表4反应体系中每种引物和探针的终浓度，使用灭菌去离子水配制含有4种目标基因引物的工作液（浓度分别为10µmol/L）和含有2种探针的工作液（浓度分别为10µmol/L）。表4目标基因引物和探针序列及每个反应体系内的终浓度引物和探针名称序列终浓度（µmol/L）沙门氏菌-F5´-AGCCAACCATTGCTAAATTGGCGCA-3´0.4沙门氏菌-R5´-GGTAGAAATTCCCAGCGGGTACTG-3´0.4内部扩增对照（IAC）-F5´-TGTGAAATACCGCACAGATG-3´0.4内部扩增对照（IAC）-R5´-AGCTGGCGTAATAGCGAAG-3´0.4沙门氏菌探针5´-FAM-TTTTTCCTCGCTGGCTACCGCTTCA-BHQ-1-3´0.2IAC探针5´-ROX-TAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCC-BHQ-2-3´0.27.9.2PCR检测体系的配制每个样品按照表5的加液量配制25µL反应体系。DBS13/003—20156表5目标基因扩增体系配制表试剂名称加样体积（µL）灭菌去离子水12.110×TaqPCR反应缓冲液2.550mmol/LMgCl22.010mmol/LdNTPs0.5引物工作液1.0探针工作液0.55U/µLTaqDNA聚合酶0.151U/µL尿嘧啶-N-糖基化酶0.25200拷贝/µLpUC19质粒DNA1.0DNA模板5.0总体积257.9.3PCR检测将配制完成的反应管放入实时荧光定量PCR仪中，按照如下步骤设置反应条件：反应步骤一：预变性，37℃4min，95℃5min，1个循环；反应步骤二：扩增和信号收集，95℃变性5s，60℃退火和延伸60s，50个循环，同时收集FAM和ROX的荧光信号。核查反应条件正确后，启动反应程序。7.9.4结果判读检测样本Ct值小于或等于40时，报告为阳性；Ct值大于40且小于50时，需要重复一次，如果Ct值仍小于50，且曲线有明显的对数增长期，报告为阳性，否则为阴性；样本没有Ct值时，报告为阴性。具体结果判定参照表6。表6沙门氏菌结果判读表沙门氏菌FAM内部扩增对照（IAC）ROX结果判读阳性阳性沙门氏菌阳性阳性阴性沙门氏菌阳性阴性阳性沙门氏菌阴性阴性阴性无效的结果当FAM通道为阳性时，可报告沙门氏菌阳性；当FAM通道为阴性，ROX通道为阳性时，可报告沙门氏菌阴性；当FAM通道和ROX通道均为阴性时，为无效的结果应重做实验。8报告8.1筛选阪崎肠杆菌和沙门氏菌阳性的样品，需分别按GB4789.40、GB4789.4进行确证。8.2报告每100g（mL）样本中检出或者未检出阪崎肠杆菌和沙门氏菌。DBS13/003—20157附录A（规范性附录）培养基和试剂的配制除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯。A.1缓冲蛋白胨水（BPW）A.1.1成分蛋白胨10.0g氯化钠5.0g磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）9.0g磷酸二氢钾1.5g蒸馏水1000mLpH7.2A.1.2制法加热搅拌至溶解,调节pH，121℃高压灭菌15min。A.2营养肉汤培养基（NB）A.2.1成分蛋白胨10.0g