DB21∕T 2106-2013 玉米种子纯度SSR分子标记鉴定方法

ICS65.020.01B21DB21辽宁省地方标准DB21/T—玉米种子纯度SSR分子标记鉴定方法SSR-basedMethodtoAssayPurityofMaizeHybridSeed点击此处添加与国际标准一致性程度的标识文稿版次选择-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T—1前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由沈阳市农业科学院提出。本标准由沈阳市质量技术监督局归口。本标准起草单位：沈阳市农业科学院、大连市农业科学院。本标准主要起草人：杨双、高红治、李金凤、马东梅、王秋艳、潘菊、刘延斌、李雪、张秋颖、韩明东、杨璐。DB21/T—2玉米种子纯度SSR分子标记鉴定方法1范围本标准规定了玉米种子纯度SSR分子标记鉴定方法的仪器设备及试剂、方法步骤、分子标记筛选、纯度计算方法。本标准适用于玉米单交种的纯度鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4404.1粮食作物种子禾谷类GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样NY/T1432玉米品种鉴定DNA指纹方法3术语和定义下列术语及定义适用于本标准。3.1种子纯度SeedPurity种子在特征特性方面典型一致的程度，本标准中指种子在SSR分子标记带型方面典型一致的程度，用具有本品种特异带型的种子粒数占检测样品种子粒数的百分率表示。3.2聚合酶链式反应PCR（PolymeraseChainReaction）一种在体外通过酶促反应扩增特异DNA片段的技术。3.3简单重复序列SSR（SimpleSequenceRepeat）由几个核苷酸（1-6个）为重复单位聚集而成的长达几十个至几百个bp（一般为100-200bp）的串联重复序列，又称微卫星序列或短串联重复序列，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。3.4分子标记MolecularMarker以蛋白质、核酸分子的多态性为基础，检测生物在遗传上的差异。DB21/T—33.5引物Primer是指一小段单链DNA，与模板DNA上特异序列互补结合后启动PCR反应。4原理SSR分布于玉米整个基因组，每个位点上重复单位的数目不同造成了品种间的多态性，利用PCR技术将多态的SSR扩增出来，通过电泳检测扩增产物，利用电泳图谱进行玉米种子纯度鉴定。5仪器设备及试剂5.1仪器设备PCR仪；测序电泳槽；水平电泳槽；高压电泳仪（3000V，400mA，400W）；万分之一电子天平；微量加样器；磁力搅拌器；台式离心机；紫外-可见成像系统；胶片观察灯；水平摇床；高压灭菌锅；pH计等。5.2试剂乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）；三羟甲基氨基甲烷（Tris）；盐酸（HCl，36%）；十二烷基硫酸钠（SDS）；氯化钠（NaCl）；氢氧化钠（NaOH）；硼酸；去离子甲酰胺；溴酚蓝；二甲苯青FF；甲叉双丙烯酰胺；丙烯酰胺；尿素；亲和硅烷；剥离硅烷；无水乙醇；四甲基乙二胺（TEMED）；过硫酸铵；冰醋酸；硝酸银；甲醛溶液（37%）；TaqDNA聚合酶（含Mg2+的10倍PCR缓冲液）；四种脱氧核糖核苷酸（dNTPs）；SSR引物；琼脂糖；GoldView染料等。5.3溶液配制相关溶液配制方法见附录A。6方法步骤6.1取样按照GB/T3543.2规定方法扦样，从送检样品中随机取不少于100粒种子。分别随机取其亲本种子各10粒。6.2单粒种子的DNA提取种子浸泡1h后，剥取种胚，置于研钵中，加入1mLDNA提取液，研磨后导入2mL离心管中，剧烈摇动混匀后，12000r离心2min，取上清液600μl移入另一个2mL离心管中，加入等体积异丙醇，轻轻混匀后于室温下静置2min，然后12000r离心2min，弃上清液，在室温下开盖放置使异丙醇挥发，最后加入200μL超纯水使沉淀溶解，即得到DNA粗提液。用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA。使用紫外-可见成像系统观察DNA电泳条带的完整性。6.3PCR扩增6.3.1反应体系DB21/T—4总体积20μL，包括11.4μL超纯水、2μL含Mg2+的10倍PCR缓冲液、1.2μLdNTPs（2.5mmol/L）、2μLSSR引物（2.5μmol/L）、0.4μLTaqDNA聚合酶（2.5U/μL）、1μLDNA，混匀。6.3.2反应程序94℃预变性5min；94℃变性40s，60℃退火35s，72℃延伸45s，循环35次；72℃延伸5min；4℃保存。6.4电泳检测6.4.1凝胶制作将玻璃板洗净，用无水乙醇擦两遍，晾干。在长板上涂1%亲和硅烷，在短板上涂2%玻璃硅烷。操作过程中防止两块玻璃板互相污染。待玻璃板彻底干燥后，将其组装好，用水平仪调平。取4.5%丙烯酰胺胶80mL，加入TEMED80μL和10%过硫酸铵400μL，迅速混匀后灌胶。灌胶过程中防止气泡产生。灌胶结束后，将梳子齿向外，轻轻的插入胶中，使其聚合1h以上。6.4.2预电泳待胶凝固后，拔出梳子，将电泳槽组装好，80W恒功率下预电泳15min~20min。6.4.3变性在20μLPCR产物中加入4μL6倍变性上样缓冲液，混匀后，在PCR仪上运行变性程序：95℃变性5min，4℃冷却10min。6.4.4电泳用洗耳球吹洗加样槽，清除气泡和杂质，插入梳子。每个加样孔加入5μL变性后的PCR产物。80W恒功率电泳至上部的指示带（二甲苯青）到达胶板的中部。6.5银染电泳结束后，小心分开两块玻璃板，凝胶紧贴在长板上。将长板置于固定液中轻轻晃动3min；双蒸水快速漂洗1次，不超过10s；染色液中染色5min；双蒸水快速漂洗1次，不超过10s；显影液中轻轻晃动直至带纹清晰；固定液中定影5min；双蒸水漂洗1min。7分子标记筛选用40对核心引物（见附录B，引用NY/T1432）进行PCR反应，扩增双亲及送检样品各10份DNA，筛选带型清晰，双亲间差异大，互补性好的引物作为纯度鉴定的SSR分子标记。8纯度计算以筛选出来的SSR分子标记为引物扩增至少100份送检样品的DNA，通过带型统计，用具有本品种特异带型的种子粒数占检测样品种子粒数的百分率表示纯度，计算公式如下：%100%检测样品种子粒数种子粒数具有本品种特异带型的纯度......................(1)DB21/T—5AA附录A（规范性附录）溶液配制A.1DNA提取液含有200mmol/LTris-HCl（pH8.0），250mmol/LNaCl，25mmol/LEDTA，0.5%SDS，经高压蒸汽灭菌后使用。A.2引物稀释按照引物合成单的说明先配制100μmol/L的储存液，取适量储存液稀释40倍，配制浓度为2.5mmol/L的使用液。A.36倍变性上样缓冲液去离子甲酰胺49mL，0.5mol/L的EDTA溶液（pH8.0）1mL，溴酚蓝0.125g，二甲苯青0.125g。A.410倍电泳缓冲液Tris108g，硼酸55g，0.5mol/LEDTA（pH8.0）溶液37mL，定容至1000mL。A.540%丙烯胺胶丙烯酰胺190g，甲叉双丙烯酰胺10g，定容至500mL。A.64.5%丙烯胺胶尿素450g，10倍电泳缓冲液100mL，40%丙烯酰胺胶112.5mL，定容至1000mL。A.71%亲和硅烷20μl亲和硅烷，20μl冰醋酸，加无水乙醇至2mL。现用现配。A.82%剥离硅烷1mL剥离硅烷，49mL三氯甲烷。A.910%过硫酸铵0.1g过硫酸铵溶于1mL超纯水中。现用现配。DB21/T—6A.10固定液200mL冰醋酸，定容至2000mL。A.11染色液4g硝酸银，定容至2000mL。A.12显影液2000mL蒸馏水中加入40g氢氧化钠和10mL甲醛。DB21/T—7BB附录B（规范性附录）40对核心引物序号名称序列01Bnlg439w1F:AGTTGACATCGCCATCTTGGTGACR:GAACAAGCCCTTAGCGGGTTGTC02Umc1335y5F:CCTCGTTACGGTTACGCTGCTGR:GATGACCCCGCTTACTTCGTTTATG03Umc2007y4F:TTACACAACGCAACACGAGGCR:GCTATAGGCCGTAGCTTGGTAGACAC04Bnlg1940k7F:CGTTTAAGAACGGTTGATTGCATTCCR:GCCTTTATTTCTCCCTTGCTTGCC05Umc2105k3F:GAAGGGCAATGAATAGAGCCATGAGR:ATGGACTCTGTGCGACTTGTACCG06Phi053k2F:CCCTGCCTCTCAGATTCAGAGATTGR:TAGGCTGGCTGGAAGTTTGTTGC07Phi072k4F:GCTCGTCTCCTCCAGGTCAGGR:CGTTGCCCATACATCATGCCTC08Bnlg2291k4F:GCACACCCGTAGTAGCTGAGACTTGR:CATAACCTTGCCTCCCAAACCC09Umc1705w1F:GGAGGTCGTCAGATGGAGTTCGR:CACGTACGGCAATGCAGACAAG10Bnlg2305k4F:CCCCTCTTCCTCAGCACCTTGR:CGTCTTGTCTCCGTCCGTGTG11Bnlg161k8F:TCTCAGCTCCTGCTTATTGCTTTCGR:GATGGATGGAGCATGAGCTTGC12Bnlg1702k1F:GATCCGCATTGTCAAATGACCACR:AGGACACGCCATCGTCATCA13Umc1545y2F:AATGCCGTTATCATGCGATGCR:GCTTGCTGCTTCTTGAATTGCGT14Umc1125y3F:GGATGATGGCGAGGATGATGTCR:CCACCAACCCATACCCATACCAG15Bnlg240k1F:GCAGGTGTCGGGGATTTTCTCR:GGAACTGAAGAACAGAAGGCATTGATAC16Phi080k15F:TGAACCACCCGATGCAACTTGR:TTGATGGGCACGATCTCGTAGTC17Phi065k9F:CGCCTTCAAGAAATATCCTTGTGCCR:GGACCCAGACCAGGTTCCACC18Umc1492y13F:GCGGAAGAGTAGTCGTAGGGCTAGTGTAGR:AACCAAGTTCTTCAGACGCTTCAGGDB21/T—819Umc1432y6F:GAGAAATCAAGAGGTGCGAGCATCR:GGCCATGATACAGCAAGAAATGATAAGC20Umc1506k12F:GAGGAATGATGTCCGCGAAGAAGR:TTCAGTCGAGCGCCCAACAC21Umc1147y4F:AAGAACAGGACTACATGAGGTGCGATACR:GTTTCCTATGGTACAGTTCTCCCTCGC22Bnlg1671y17F:CCCGACACCTGAGTTGACCTGR:CTGGAGGGTGAAACAAGAGCAATG23Phi96100y1F:TTTTGCACGAGCCATCGTATAACGR:CCATCTGCTGATCCGAATACCC24Umc1536k9F:TGATAGGTAGTTAGCATATCCCTGGTATCGR:GAGCATAGAAAAAGTTGAGGTTAATATGGAGC25Bnlg1520k1F:CACTCTCCCTCTAAAATATCAGACAACACCR:GCTTCTGCTGCTGTTTTGTTCTTG26Umc1489y3F:GCTACCCGCAACCAAGAACTCTTCR:GCCTACTCTTGCCGTTTTACTCCTGT27Bnlg490y4F:GGTGTTGGAGTCGCTGGGAAAGR:TTCTCAGCCAGTGCCAGCTCTTATTA28Umc1999