DB32∕T 1771-2011 猪支原体肺炎诊断技术

ICS65.020.30B41备案号：江苏省地方标准DBDBDBDB32323232DB32/T1771—2011猪支原体肺炎诊断技术DiagnosticTechniquesforMycoplasmalpneumoniaofswine2011-05-06发布2011-07-06实施江苏省质量技术监督局发布DB32/T1771—2011I前言为规范猪支原体肺炎诊断技术，特制定本标准。本标准按GB/T1.1—2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》编制。本标准由江苏省农业科学院提出。本标准起草单位：江苏省农业科学院。本标准起草人：刘茂军、邵国青、冯志新、王海燕、周勇岐、苏国东、孙佩元、甘源。DB32/T1771—20111猪支原体肺炎诊断技术1范围本标准规定了猪支原体肺炎的诊断技术。本标准规定的分离鉴定和PCR法适用于本病的确诊，间接血凝试验和ELISA试验适用于大批量样品的普查。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修订单）适用于本文件。GB/T6682—2008分析实验室用水规格和试验方法GB16548病害动物和病害动物产品生物安全处理规程NY/T541动物疫病实验室检验采样方法NY/T1186猪支原体肺炎诊断技术DB32/T1461猪肺炎支原体检测PCR法3术语和定义下列术语和定义适用于本标准3.1猪支原体肺炎猪支原体肺炎（Mycoplasmalpneumoniaofswine，MPS)，俗称为猪气喘病或猪地方流行性肺炎（EnzooticPneumoniaofSwine,EPS）。它是由猪肺炎支原体（Mycoplasmahyopneumoniae）引起的一种呼吸道疾病，是全世界广泛存在的一种严重危害养猪业健康发展的主要猪病之一。我国是世界养猪大国，每年在MPS上损失百亿元以上。本病还诱导免疫缺陷，特别是当前蓝耳病广泛的存在，混合感染给养猪业带来更大损失，对规模化养猪意义重大。我国将其列为二类动物疫病。4流行病学诊断4.1易感动物猪气喘病仅发生于猪，不同品种、年龄、性别的猪均能感染，其中以哺乳猪和幼猪最易感，发病率高，病死率低；其次是妊娠后期的母猪和哺乳母猪，育肥猪发病较少。4.2易感季节一年四季均可发生，但冬春寒冷季节较多见。4.3诱发因素DB32/T1771—20112猪舍通风不良、猪群拥挤、气候突变，阴湿寒冷、饲养管理和卫生条件不良可促进本病发生，加重病情。5临床诊断5.1急性型病猪剧喘，腹式呼吸或犬坐姿势，时发痉挛性阵咳。体温一般正常。食欲大减或废绝，日渐消瘦。病程约1周，病猪常因窒息而死，病死率高。5.2慢性型长期咳嗽，清晨进食前后及剧烈运动时最明显，严重的可发生痉挛性咳嗽。病猪体温不高，但消瘦，发育不良，被毛粗乱。病程长达2个月～3个月，有的在半年以上，病死率不高。6病理学诊断6.1大体病变特征性病变是肺的心叶、尖叶和膈叶前缘发生对称性的紫红色到灰色的实变，肺门淋巴结肿大、增生。刀切肺脏，质度变硬、重量增加，气管中有黏液性渗出物。病死猪及病料应符合按GB16548的规定。6.2组织学病变典型病变组织通过用常规的病理切片、染色、脱色后观察，支气管和细支气管上皮组织纤毛数量减少，小支气管周围的肺泡扩大，泡腔充满多量炎性渗出物，肺泡间组织有淋巴样细胞增生。急性病例中，扩张的泡腔内充满浆液性渗出物，杂有单核细胞，中性粒细胞，少量淋巴细胞和脱落的肺泡上皮细胞。慢性病例，其肺泡腔内的炎性渗出物中，主要是淋巴细胞浸润。7病原学诊断7.1病原分离与鉴定7.1.1材料准备除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682—2008的灭菌二级水。Hank's液,KM2液体培养基，KM2固体培养基,兔抗猪肺炎支原体高免血清和健康兔血清，灭菌棉拭子。7.1.2病料采集按NY/T541规定的方法采样。病猪用棉拭子深擦病猪的喉头或鼻腔，采集呼吸道分泌物。病死猪及剖杀猪，无菌操作采取具有特征的病肺与健肺连接处的肺组织。7.1.3病原分离7.1.3.1液体培养将病肺组织切成2mm3以下的碎块，浸入Hank's液中洗涤，除去血液和组织碎块，取3块～5块浸泡在盛有5mLKM2液体培养基的试管中；棉拭子浸入约1mLKM2液体培养基中清洗，并压出棉花中残液，在37℃进行培养。1代～3代分离时须每经3d～5d，以20%的接种量连续进行移植；至4代～5代以后，DB32/T1771—20113再经5d～7d连续转移以提高分离率。通过连续继代，当培养物出现有规则的变色时，应涂片镜检；观察到典型的支原体7.1.3.2固体培养将液体培养物作适当稀释后再接种于固体培养基上，在含5%～l0%CO2的环境中37℃培养3d～10d。培养时应逐日在低倍镜下观察，若出现圆形、边缘整齐、似露滴状、中央有颗粒、稍隆起的小菌落，判为可疑菌落，需进一步进行鉴定。7.1.4病原鉴定7.1.4.1代谢抑制试验取不含血清的KM2培养基加入兔抗猪肺炎支原体J株高免血清，按20%接种分离菌株，37℃培养5d～10d，进行代谢抑制试验。同时接种加入健康兔血清的KM2培养基作为对照。如对照变色，镜检有大量支原体菌体存在，试验组未变色，则判定分离菌株为猪肺炎支原体。7.1.4.2聚合酶链式反应（PCR）支原体培养物按照7.2的方法检测和判定。7.1.5结果判定以上实验皆为阳性判为猪肺炎支原体。7.2猪肺炎支原体聚合酶链式反应（PCR）采集的待检猪肺脏和可疑培养物样品，按DB32/T1461规定的方法进行检测和判定。8血清学检测8.1间接血凝试验（IHA）按NY/T1186第5章规定的方法进行检测和判定。8.2酶联免疫吸附试验（ELISA）8.2.1材料准备猪肺炎支原体酶联抗原，酶标抗体，标准阴性血清、标准阳性血清，酶标板及其他必要的试验溶液和酶标仪、移液器等仪器。8.2.2操作步骤8.2.2.1包被用包被液将猪肺炎支原体酶联抗原稀释到工作浓度加入做好标记的酶标板孔内，每孔100μL，37℃作用1h后，置4℃冰箱过夜。8.2.2.2洗涤甩掉酶标板孔内的液体，加入洗涤液，室温下浸泡3min，甩去洗涤液，再重新加入洗涤液，连续洗3次，最后一次甩掉洗涤液后，拍干酶标板。DB32/T1771—201148.2.2.3封闭各孔加人封闭液100μL，37℃作用1h。按8.2.2.2步骤洗涤。8.2.2.4加入待检血清和阴、阳性血清对照待检血清用稀释液稀释，每孔加100μL。同时将阴、阳性血清作对照。37℃作用1.5h，重复8.2.2.2步骤。8.2.2.5加入酶标抗体用稀释液将酶标抗体按工作浓度稀释，每孔加入100μL，37℃作用1h，重复8.2.2.2步骤。8.2.2.6加入底物每孔加100μL，室温避光显色5min～10min。8.2.2.7终止反应每孔加入50μL终止液终止反应。8.2.2.8测定光吸收值(OD)在酶联免疫检测仪上于490nm波长处测定光吸收值(OD)。8.2.3结果判定用酶标仪检测OD值，以空白对照调零，S为各检测孔的值，N为阴性对照的平均值，P为阳性对照的平均值。P／N≥2.1时，试验成立。S／N≥2.1时判定为阳性，反之，判为阴性。9最终结论判定下列任何情况之一，均可判为猪肺炎支原体感染猪：a）发病不分年龄、季节、个体临床表现明显，病例解剖病变典型，用第7章中任何一种试验确诊为猪肺炎支原体阳性者；b）临床症状和发病情况不详，群体解剖检查病变典型，用第7章中任何一种实验确诊为猪肺炎支原体阳性者；c）发病情况、临床症状、病理变化不详，如用第7章中任何一种实验确诊为猪肺炎支原体阳性者；d）未免疫过猪支原体肺炎疫苗，如用第8章中任何一种实验确诊为猪肺炎支原体抗体阳性者。