小麦组织培养研究进展

，赵晖21.甘肃省农科院旱地农业研究所，兰州（730070）2.甘肃农业职业技术学院小麦育种研究所，兰州(730020)E-mail：[e-mail]摘要：小麦组织培养是利用基因工程改良小麦品种的重要基础和保证。对不同小麦外植体(幼胚、幼穗、成熟胚、幼叶、根、小孢子、花药、原生质体等)组织培养研究现状进行了综述。关键词：小麦，外植体，组织培养1.前言小麦是世界上分布范围和栽培面积昀广，总产量昀多的粮食作物，在我国种植面积仅次于水稻，是我国人民的主要粮食作物之一[1]。随着生物技术的发展，运用基因工程进行小麦品种改良越来越受到国内外育种家的重视，并已成为世界各国作物遗传育种优先研究的课题之一。而外源基因通过基因工程技术向小麦的转移要求建立高效的离体培养系统，这种系统必须对广范围的基因型而言是快速、可靠和适用的。因此，小麦高效组织培养系统的建立仍是许多研究者关注的科学问题之一。2.小麦组织培养研究现状2.1幼胚组织培养自1978年Shimada[2]成功地通过小麦幼胚培养获得再生植株以来，幼胚被共认为是小麦组织培养昀有效、昀理想的外植体来源之一[3]。在小麦幼胚培养中，如何确定胚龄是一个令人困惑的问题，首先是如何确定胚龄的衡量标准问题，一些学者选用“一定长度”或“直径”的胚作为衡量胚龄的标准[4]。而另有学者则倾向于选用“受粉后发育时间”作为衡量胚龄的标准[5]。其次，是昀适胚龄的确定，因为不同品种、不同地区昀佳胚龄不同[6]。王常云等[7]认为烟台地区冬小麦的有效胚龄为14-20天，昀适胚龄为16天，具体到每个品种，昀适胚龄只有一天，且取决于基因型。Ｓ.Ito等[8]认为取授粉后10天的幼胚培养较为适宜。覃建兵等[9]研究表明昀适于培养的未成熟胚大小为0.15-0.20cm之间。梁竹青等P[4]通过三年的试验，选用直径为1.0-1.5mm的未成熟胚作为胚培养的的“昀适胚龄”,安海龙等[10]认为幼胚直径在0.5-0.8mm为宜。关于幼胚的取材时机，虽然人们标准各异，但是还有个参照范围。在实际应用中以授粉后的时间间隔为标准进行取材较为方便。通过对麦基一号、MS、white、BB5、Miller、N6及C17等多种培养基进行比较研究，结果发现MS培养基为昀佳的基本培养基。在MS基本培养基中添加谷氨酰胺、天冬酰胺、椰子乳等物质，有利于愈伤组织的形成及植株分化，在继代培养中提高盐浓度（2MS）或加适量的水解酪蛋白（300-500mg/ml）均有利于胚性愈伤组织的生长及绿苗的形成，调节铵态氮和硝态氮的比例可以提高小麦植株分化频。目前，幼胚培养一般均用MS作基本培养基，少数以MB（MS无机盐，B[8][10，11][12][13]5有机物）做基本培养基，生根壮苗时用1/2MS培养基。[14]在诱导幼胚愈伤组织过程中，2，4-D是用的昀广泛的生长素类激素。研究者们普遍认为2，4-D对小麦幼胚培养胚胎发生具有关键作用。2，4-D的使用浓度在0.5-5mg/ml不等。2mg/ml2，4-D是诱导盾片愈伤组织的适宜浓度，并抑制胚的早期萌发[15]。低浓度的2，4-D-1-（小于0.1mg/ml）对愈伤组织没有促进作用，其浓度较大时（大于2.5mg/ml）可以提高愈伤组织活力，但将降低植株再生能力，使胚性愈伤组织转变成非胚性愈伤组织[16]，Naborsetal[17]认为2，4-D单独使用时会促进非胚性愈伤组织的形成。不同品种对2，4-D浓度的反应均不相同，各品种分化率的变化随2，4-D浓度的增加呈单峰曲线变化[14]，2，4-D浓度的变化对出愈率影响研究结果并不一致[18]。安海龙等[10]认为，对小麦致密愈伤组织而言，愈伤组织本身分化潜能对小麦幼胚愈伤组织分化特性的影响似乎要大于外源激素的影响。在愈伤组织的再分化研究方面，主要有两种分化培养基被研究者采用。一种是培养基中不加任何激素[19]。另一种是在基本培养基中添加KT、BA等细胞分裂素和少量的生长素如IAA等[20]。在生根方面，人们常用低浓度的NAA或适度浓度IAA来促进生根[5]。对于小麦幼胚的培养条件，研究者得出了许多观点，TiwariVK等[20]认为液体培养基比固体培养基好，液体培养基有利于幼胚及其愈伤组织吸收营养。MukeshDahiya等[21]认为愈伤组织诱导时，对光的需要随基因型而定。在其它方面研究表明，盾片向下放置易使胚直接萌发，盾片向上放置易产生愈伤组织[7，10]，致密愈伤组织诱导盾片向上显著高于盾片向下，而分化频率没有显著的差异[10]。李洪杰等[22]研究表明，适当地辐射处理小麦幼胚，可以提高植株再生频率或分化率。于晓红等[5]认为，干燥处理适当的时间，可以有效的提高植株的分化频率。4℃处理幼胚时间超过3天，则使愈伤组织诱导率和分化率降低[10]。不少研究者认为，随着培养时间的延长，愈伤组织分化能力呈下降的趋势[22，23]。小麦幼胚培养中，小麦基因型、培养基等对小麦愈伤组织的形成及植株在生有重要的影响，但对于每一个基因型，都能找到合适的培养基提高培养效率[22，24]。2.2幼穗组织培养自Chin等[25]从小麦幼穗诱导产生愈伤组织以来,小麦幼穗组织培养的研究主要集中在培养基、培养条件及基因型等几个方面。颜昌敬等[26]研究表明，0.3-1.0cm的小麦幼穗愈伤组织出现早，生长快，小于1mm的则较难培养，2cm愈伤组织出现的少而迟。刘瑞凝等[27]报道护颖分化期的培养效率昀高，而肖海林等[28]报道，护颖分化期昀差。何勇刚等[29]的研究表明，0.5-1.0cm长的幼穗处于诱导分化的昀佳时期。而YadavaR等[30]认为，1-2cm长的幼穗适宜于诱导愈伤组织及植株分化培养。关于幼穗昀佳取材时期，虽然研究结果不一，但可以提供一个参考范围。小麦幼穗愈伤组织诱导及愈伤组织分化等方面受基因型影响很大，长时间的培养使得培养物分化能力减弱[29，30]，固体培养基比液体培养基诱导的愈伤组织有更高的形态建成能力[31]。YadavaR等[30]在培养基中添加不同的氨基酸、椰子乳、水解酪蛋白（CH）取得了很好的效果。Houbingkai等32]认为，短时间的低温处理幼穗明显提高再生频率。肖海林等[28]认为在培养基中添加CH、BAP、NAA不利于幼穗愈伤组织生长。李士生[33]研究表明提高6-BA的浓度，添加AgNO3有利于小麦愈伤组织分化成苗。小麦幼穗离体培养与幼胚的离体培养幼许多相似之处，但从幼穗培养中获得的高频再生体系的报道并不多。2.3成熟胚组织培养小麦成熟胚作为外植体具有取材方便、不受季节的限制等优越性[34]。所以，它作为外植体进行离体培养，引起了研究者的关注[35]。在小麦成熟胚离体培养中，培养效应同样受基因型的影响，成愈率高的基因型，其愈-2-伤组织的分化率不一定高，成愈率低的基因型，其愈伤组织的分化率不一定低[36]。随着培养时间的延长，其愈伤组织分化能力及其成株能力下降[5]。小麦成熟胚离体培养研究中，MS也是研究者用的昀多的培养基，和其它外植体相比，小麦成熟胚对2，4-D的耐受受程度较强[37]。MendozaMG等[38]研究表明，Picloram虽然对愈伤组织形成有利，但对再分化不利，Dicamba比2，4-D有更好的效果。Meenakshhisidana等[39]研究表明，2，4，5-T对愈伤组织的诱导与分化有利。李宏潮等[40]研究指出，ABA对小麦成熟胚愈伤组织根分化有利。于晓红等[5]指出，ABA有利于小麦成熟胚愈伤组织的诱导愈伤组织再生能力的保持。随着对成熟胚离体培养研究的不断深入，人们在这方面取得了很大的进展。OzgenM等[36]采用胚乳支持法取得了很好的效果。出愈率和分化率分别达到90%和80%以上。虽然在小麦成熟胚培养方面取得了一定的进展，但还面临这许多问题。譬如，怎样提高成熟胚来源愈伤组织分化率、寻求对各基因型较适合的培养基等。2.4幼叶组织培养在生物技术育种中,对植物叶片进行离体培养有重要的意义[41]。但是，禾谷类作物的叶片一直被研究者认为很难获得愈伤组织，因而提出了禾谷类作物叶片细胞是否具有全能性的疑问[42]。现在研究表明，禾谷类叶片能够诱导出愈伤组织，但愈伤组织再生能力特别差[43]。王万军等[44]研究表明，小麦幼叶愈伤组织可诱导产生大量绿点，其绿苗诱导率极低，一些基因型的愈伤组织不能发育出绿苗。迄今为止，有关小麦叶为外植体进行离体培养的报道很少。2.5根组织培养早在1951年就报道了离体小麦根的人工培养，但未能获得愈伤组织[45]。直至1968年，Trioneetal首次从小麦根外植体诱导出愈伤组织[46]。1977年，Chin等从小麦根外植体诱导的愈伤组织实现了不定根的发育，未诱导出芽器官的发育[47]。同年，Bhojwani等从小麦根外植体来源的愈伤组织获得了极少的再生植株，重复实验未能成功[48]。直到昀近，蔡润等[49]在20℃培养条件，含4mg/ml2，4-D的培养基中获得了22.6%的再生植株，使小麦根离体培养取得了一定的进展。2.6原生质体培养早在1988年，Harris等[50]从小麦胚性愈伤组织分离原生质体进行培养获得再生植株。随后，我国的研究者也获得了类似的报道[51]。郭光沁等[52]用半冬性小麦幼胚诱导建立的胚性愈伤组织游离原生质体，通过原生质体培养，再生细胞分裂，直接形成体细胞胚，进而再生成完整的绿色植株。李宏潮等[53]通过对两个冬小麦品种的胚性悬浮细胞培养和原生质体培养，分别获得了再生愈伤组织和完整植株。在原生质体培养中，常用的培养基有KM8PP[54]、MS、N6等[55]，其中，KM8P培养基培养效果较好。大量研究表明，通过选择适当的外植体，几乎所有的小麦基因型都能诱导出愈伤组织，但要获得理想原生质体培养的基因型却十分困难[56]。即使一个好的基因型，通常要经过繁杂的过程才能建立起胚性悬浮系[53]，其实验周期一般需要一年以上。如此长的培养过程增加了细胞的变异性，又减弱了愈伤组织的分化能力。总之，小麦原生质体培养目前存在许多问题，即受基因型、实验材料的发育状况、制备原生质体的酶系统、培养基及培养条件等因素的影响，使得原生质体成株率不高。从而限制了原生质体培养技术在小麦遗传育种中的广泛应用。-3-等[57]首次成功的进行了报道。我国也曾在20世纪90年代前后开展过小麦小孢子培养的研究,但由于无突破性的进展而终止。但近几年来,国外这方面的研究十分活跃,并取得了重大突破,使小孢子培养基本可用于育种实践[58]。在小麦游离小孢子培养中，许多因素影响小孢子培养过程中植株分化频率。譬如，供体植物花药的生理状态、小孢子的发育阶段、离体培养条件、供体材料的基因型等，另外，细胞质对小孢子胚胎发生有明显的影响[59]。低温处理（4℃，2-3周）在花药培养中已广泛使用,也是提高小孢子胚胎发生的有效方法[60]。李光威等[61]认为,小麦小孢子游离之前采用饥饿预处理有助于胚状体和愈伤组织形成。ToureavAetal[62]认为，高温和饥饿处理对胚胎的发生具有叠加作用，并且各种胁迫处理方法是可以相互取代的。兰素缺等[63]研究认为，小麦游离小孢子培养中，麦芽糖是昀好的糖源。在胚胎再生方面，ToureavA[62]报道了以改良的诱导培养基（2%的蔗糖代替9%的麦芽糖作为碳源）作为再生培养基,可以改善胚胎的再生能力,大约60%的胚胎都可发育成小植株。目前,国外在小麦小孢子培养方面已有了很大的突破。一个培养皿中可产生成百上千个胚胎和上百个单倍体再生植株。另外，小孢子培养省时、省力,在育种实践中具有更好的应用前景。但近几年来，我国在这一领域的研究因重视不够而基本停滞。所以，有必要重新组织人力、物力进行研究和跟