水通道蛋白1及4在大鼠喉组织中的表达

，张庆丰2，董震1，杨占泉11.吉林大学中日联谊医院，长春（130031）2.大连市中心医院，大连（116033）E-mail：[e-mail]摘要：目的检测水通道蛋白1（aquaporin1，AQP1）及4（aquaporin4，AQP4）在大鼠喉组织中的表达，以探讨AQP1及AQP4在喉部的分布及在喉部疾病发病过程中可能的作用机制和意义。方法正常大鼠喉组织标本8例，HE染色用于常规组织病理学检查，免疫组织化学染色用于观察AQP1及AQP4的表达部位。结果AQP1主要表达于大鼠喉粘膜固有层的血管内皮细胞、喉粘膜腺体及肌细胞核膜上。AQP4主要表达于大鼠喉粘膜鳞状上皮、假复层柱状纤毛上皮、固有层粘膜腺体及肌细胞膜上。结论AQP1及AQP4表达于大鼠喉的不同部位，在喉部水转运中起不同的作用,或许在喉部疾病中具有重要作用。关键词：水通道蛋白；喉；免疫组化水是细胞和细胞间隙的主要成份,细胞内外一切生命活动都是在水的微环境中进行，多种机体活动中都存在水的跨细胞膜转运。水通道蛋白(aquaporins,AQPs)是对水专一的通道蛋白,普遍存在于动、植物及微生物中。它所介导的自由水快速被动的跨生物膜转运,是水进出细胞的主要途径，许多疾病可能与水通道蛋白功能异常或调节失控有关。呼吸道粘液的分泌和调节与水通道蛋白的表达密切相关[1]，目前已有研究证实AQPs在哮喘、肺水肿[2]及鼻息肉[3]等呼吸道疾病中具有重要作用，喉是呼吸道的一部分，本研究应用免疫组化技术对大鼠喉中的AQP1及AQP4进行检测，以探讨其在喉部的分布及与喉部疾病发病过程中可能的作用机制和意义。1.材料与方法1.1材料选用成年健康wistar大鼠8只(购于吉林大学基础医学院动物中心),体重200±25ｇ,雌雄各4只。大鼠经水合氯醛过度麻醉后断颈处死，快速取出喉部组织。标本以4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，做5µm厚的连续切片，取出部分切片做HE染色（图1），以确定组织类型。1.2主要试剂兔抗AQP1及AQP4多克隆抗体（武汉博士德生物技术公司），SABC免疫组化染色试剂盒及DAB显色试剂盒（武汉博士德生物技术公司）。1.3检测方法SP(streptavidinperoxidase)免疫组化染色法：按照产品说明书采用链霉素-抗生物素-过氧化物酶技术对标本进行常规免疫组化染色，石蜡切片梯度酒精脱蜡至水后，3%H2O2孵育10min消除内源性过氧化物酶活性，微波修复抗原10min，滴加正常山羊血清，室温孵育20min，倾去血清，分别滴加一抗AQP1多克隆抗体（1：100）或AQP4多克隆抗体（1：100）。4°过夜，经PBS洗后行免疫组化染色，3，3ˊ-二氨基联苯胺（3，3ˊ-diaminobenzidine,DAB）1本课题得到国家自然科学基金项目资助课题（30371524）和教育部博士点专项科研基金项目（20030183049）的资助。显色，Mayer苏木素复染，封片。以胞膜及胞浆有棕黄色染色者为阳性细胞。用PBS代替一抗作为阴性对照，以大鼠肾脏组织作为阳性对照。1.4结果判定所有切片在光学显微镜下观察，取染色良好（阳性细胞染色清晰，背景染色很低）的组织切片，观察AQP1及AQP4在大鼠喉内的表达部位。2.结果光学显微镜下见：AQP1和AQP4在大鼠喉内均有表达，但表达部位明显不同。AQP1主要表达于大鼠喉粘膜固有层的血管内皮细胞、红细胞膜、喉粘膜腺体及肌细胞核膜上，以及部分浆细胞，纤维母细胞和淋巴细胞的胞膜及胞浆上，上皮层无表达（图2，3）。AQP4主要表达于大鼠喉粘膜鳞状上皮、假复层柱状纤毛上皮、固有层粘膜腺体,红细胞膜及肌细胞膜上（图4，5）。血管内皮无表达。3.讨论水通道蛋白（aquaporins,AQPs）是一组糖蛋白,分子量约30kDa左右,属古老的跨膜通道蛋白MIP(majorintrinsicprotein)家族成员，选择性地分布在那些与体液吸收或分泌有关的上皮细胞及可能协同液体跨细胞转运的内皮细胞中,执行着各部位的水分重吸收、液体分泌和细胞内外水平衡功能。到目前为止已克隆的哺乳动物水通道蛋白家族有11个成员(AQP0-AQP10)[4],肺组织中的AQP有6种,即AQP1，3，4，5，8和9[5～7]，其中AQP1及AQP4表达昀多。上世纪90年代以后的大量研究证实，细胞代谢过程中所需要的水主要是通过AQPs对水分子的高度选择性来完成跨膜转运的[8～9]。不同的细胞和组织内AQPs参与在生理和病理条件下细胞内外水的即刻分布[10]。由于水转运发生的细胞体积变化而引起的质膜扩展或收缩，可激活质膜上的机械性门控离子通道或机械性受体,继而激活某些信号的传导[11]，调整细胞的液体转运。有学者发现[12]，细胞死亡时昀早的事件是细胞内水经水通道的外溢，推测AQPs的功能与细胞凋亡有密切关系。因此，AQPs表达或功能的改变不仅对水分子的传输产生明显影响，而且对细胞的生命活动也至关重要。已有研究证实AQP在组织中的分布有一显著特点,各种AQP有其相对的组织细胞分布谱和细胞表达位置（顶膜或侧基膜），同一脏器可以拥有多个AQP,且同一AQP也可以分布于多种组织细胞中,但在同一细胞定位上,没有两种以上的AQP重叠表达,说明每种AQP具有特殊的地位和作用[13]，以满足不同组织和细胞的代谢需要。这种现象提示AQPs之间在功能上不仅相对独立,而且存在协同作用。本研究应用免疫组化证实AQP1和AQP4在大鼠喉内均有表达，但表达部位明显不同。AQP1主要表达于大鼠喉粘膜固有层的血管内皮细胞上，上皮层无表达。AQP4主要表达于大鼠喉粘膜鳞状上皮、假复层柱状纤毛上皮上，血管内皮无表达。它们在分布上的不一致提示二者在喉中的功能不同。AQP1是第一个发现的水通道蛋白，几乎在全身各处都有分布。毛细血管内皮是毛细血管间水转运的主要障碍,Verkman研究发现如小鼠肺毛细血管内皮缺乏AQP1,肺泡毛细血管间水的渗透力可下降90%[14]，证实呼吸道中水通过毛细血管运输主要由AQP1介导。AQP1大量表达于喉部血管内皮细胞中，证实AQP1可以使水快速通过毛细血管内皮细胞进入周围的组织液中，调控细胞间液体量和血管容积的流体静压与胶体膨胀压，满足喉部细胞代谢需要，对维持喉部正常生理功能具有重要作用。已有研究证实多数肿瘤有很高的组织间隙液体压力，其新生血管对血浆蛋白及其他循环体系中的高分子物质具有很高的渗透[15]。喉癌肿瘤血管生成明显增多，且与转移或复发有明显的关系[16]。我们在另一项研究中已经证实AQP1大量表达于喉癌组织毛细血管内皮细胞，其表达量较正常组织明显增多（待发）。AQP1通过增加肿瘤上皮和血管对水的渗透性运输，促进肿瘤血管生成，从而促进肿瘤的生长及转移。同AQP1相比，AQP4在机体内的分布范围小，虽然二者均具有高度选择性水通透性,即除水之外不转运其它小分子溶质，但AQP4是一种汞不敏感性水通道蛋白。实验证实，AQP1敲除小鼠肺泡毛细血管间水的渗透性较野生型降低10倍,去除AQP4的小鼠与野生型比较,肺泡毛细血管水通透性并无明显区别,但在AQP1缺失的小鼠再去除AQP4,肺泡毛细血管间水通透性下降14～16倍[17]。以上结果充分说明尽管AQP1及AQP4都具有水转运功能，但其分布位置及在局部微环境中所起的作用是不同的。一个部位有多种AQPs分布，可以保证细胞以很少的能量从周围吸收水分，维持细胞正常的代谢以及复制和生存需要。AQP4主要表达于喉粘膜上皮细胞膜上，AQP1及AQP4在喉部粘液腺上表达，这对于喉部粘液正常分泌，维持气道湿度具有重要意义。它们的表达异常及功能紊乱或许同各种原因导致的急性喉水肿有关。皮质醇类激素是治疗急性喉水肿昀有效的药物，研究表明它可以增加AQPs的表达[18],进而增加气道局部细胞膜的水渗透性,促进水肿的吸收,既为临床激素治疗喉水肿提供了一种理论依据，又进一步证实AQPs在喉水肿发病中具有重要作用。但AQPs对喉部生理功能的调控机制及在喉部疾病中的具体作用尚有待于进一步研究。参考文献1、AdlerKB,LiY.Airwayepitheliumandmucus:intracellularsignalingpathwaysforgeneexpressionandsecretion.AmJRespirCellMolBiol.2001，25(4):397-4002、KingLS,NielsenS,AgreP.Aquaporinsandtherespiratorysystem:adviceforalunginvestigator.JClinInvest.2000，105(1):15-163、关桂梅，董震，吕梅.鼻息肉组织嗜酸粒细胞中水通道蛋白-1和抗凋亡基因Bcl-2mRNA的表达及意义.中华耳鼻咽喉科杂志，2004，39:476-4784、AgreP,KozonoD.Aquaporinwaterchannels:molecularmechanismsforhumandiseases.FEBSLett，2003，555:72-785、LeeMD,KingLS,NielsenS,etal.Genomicorganizationanddevelopmentalexpressionofaquaporin-5inlung.Chest，111:111S-113S6、IshibashiK,KuwaharaM,GuY,etal.Cloningandfunctionalexpressionofanewaquaporin(AQP9)abundantlyexpressedintheperipheralleukocytespermeabletowaterandurea,butnottoglycerol.BiochemBiophysResCommun，1998，244:268-2747、MaT,YangB,VerkmanAS.Cloningofanovelwaterandurea-permeableaquaporinfrommouseexpressedstronglyincolon,placenta,liver,andheart.BiochemBiophysResCommun，1997，240:324-3288、PrestonGM,AgreP.IsolationofthecDNAforerythrocyteintegralmembraneproteinof28kilodaltons:memberofanancientchannelfamily.ProcNatlAcadSciUSA，1991，88:11110-111149、BaiC,FukudaN,SongY,etal.Lungfluidtransportinaquaporin-1andaquaporin-4knockoutmice.JClinInvest，1999，103:555-56110、KingLS,YasuiM,AgreP.Aquaporinsinhealthanddisease.MolMedToday，2000，6:60-6511、AcherR.Waterhomeostasisintheliving:molecularorganization,osmoregulatoryreflexesandevolution.AnnEndocrinol，2002，63(3):197-21812、JablonskiEM,WebbAN,McConnellNA,etal.Plasmamembraneaquaporinactivitycanaffecttherateofapoptosisbutisinhibitedfollowingtheapoptoticvolumedecrease.AmJPhysiolCellP