DB32T 1533-2009 饲料中桔青霉素的检测 酶联免疫吸附法

ICS65.120B46备案号：26253-2009江苏省地方标准DB32DB32/T1533—2009饲料中桔青霉素的检测酶联免疫吸附法Determinationofcitrinininfoodstuff--enzymelinkedimmunosorbentassay2009-10-16发布2009-12-16实施江苏省质量技术监督局发布DB32/T1533—2009前言桔青霉素是由青霉属和曲霉属的某些真菌产生的一种真菌毒素，自然界中的桔青霉素主要由桔青霉和雪白曲霉产生。桔青霉素主要污染玉米、小麦等粮食作物及饲料。本标准按GB/T1.1－2000《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则》、GB/T1.2－2002《标准化工作导则第2部分：标准中规范性技术要素内容的确定方法》编写。本标准由南京农业大学提出。本标准起草单位：南京农业大学。本标准主要起草人：张海彬、何成华、刘海明、王希春、欧阳伟、樊彦红、张爱华、吴文达。DB32/T1533—20091饲料中桔青霉素的检测酶联免疫吸附法1范围本标准规定了饲料中桔青霉素酶联免疫吸附法检测的术语和定义、原理、设备与试剂、检测步骤。本标准适用于饲料原料、配合饲料或混合饲料中的桔青霉素酶联免疫吸附法。本方法的最低检出量为2.5µg/g。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T14699.1-2005饲料采样3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1桔青霉素citrinin桔青霉素是由青霉属和曲霉属的某些真菌产生，自然界中的桔青霉素主要由桔青霉和雪白曲霉产生。4原理桔青霉素的分子式是C13H14O5，分子量为250。其化学命名是（3R,4S）-4,6-二氢-8-羟基-3,4,5-三甲基-6-氧-3H-2-苯吡-7-羧酸。常温下为黄色结晶物，熔点为172℃。在长波紫外灯的激发下能发出黄色荧光，其最大紫外吸收峰在319nm,253nm和222nm。在适宜pH条件下，桔青霉素能溶解于水及大多数有机溶剂，并容易在冷乙醇溶液中结晶析出。在水溶液中，当pH下降到1.5时也会有结晶析出。热稳定性强，一般的烹调及加热不能破坏其毒性。待检样品中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合，如待检样品中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如待检样品中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合。待检样品中抗原含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，则其最后加入酶底物后显色也愈浅。颜色的深浅与待检样品中抗原含量成反线性相关。5设备与试剂5.1设备5.1.1酶标检测仪。5.1.2酶标板（48孔或96孔）。5.1.3电动震荡器。5.1.4隔水式恒温培养箱。5.2试剂DB32/T1533—20092本检测方法所用试剂，凡未指明规格者，均为分析纯，水为蒸馏水或等纯度的水。5.2.1甲醇。5.2.2桔青霉素单克隆抗体。5.2.3酶标桔青霉素抗原溶液：桔青霉素与辣根过氧化酶结合物。5.2.4包被缓冲液：碳酸钠（Na2CO3）1.59g，碳酸氢钠（NaHCO3）2.93g，加水溶解，调pH至9.6，定容至1000mL。5.2.5洗涤液（PBS-T）：磷酸二氢钾（KH2PO4）0.2g，磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）2.7g，氯化钠（NaCl）8.0g，氯化钾（KCl）0.2g，吐温-200.5mL，加水溶解，调pH至7.4，定容至1000mL。5.2.6桔青霉素标准贮备溶液：称取适量的桔青霉素标准品，用甲醇配制成1mg/mL的桔青霉素贮备液。贮备液置于4℃冰箱中避光保存。注1：凡接触过桔青霉素的容器，需浸入4%次氯酸钠（NaOCl）溶液，半天后清洗。注2：为了安全，分析人员操作时要带上医用乳胶手套。5.2.7桔青霉素标准溶液：精确吸取标定后的标准贮备液，用甲醇新鲜配制成桔青霉素标准溶液，浓度分别为0µg/mL、1µg/mL、2µg/mL、3µg/mL、4µg/mL。5.2.8底物缓冲液（pH5.0的磷酸-柠檬酸缓冲液）：A液（0.1mol/L柠檬酸）：柠檬酸（C6H8O7﹒H2O）21.0g，加水至1000mL；B液（0.2mol/L磷酸氢二钠）：磷酸氢二钠（Na2HPO4）28.4g，加水至1000mL；取A液24.3mL，B液25.7mL，混合，加水至100mL。5.2.9底物溶液：取10mg四甲基联苯胺（TMB）加5mL无水乙醇，配成TMB无水乙醇混合液。取9.5mL底物缓冲液和32μL0.75%过氧化氢，加入0.5mLTMB无水乙醇混合液，混匀。5.2.10终止液：1.25mol/L硫酸溶液，浓硫酸21.7mL缓慢滴加到178.3ml水中。6检测步骤6.1样品饲料原料、配合饲料或混合饲料。6.2样品制备按GB/T14699.1-2005饲料采样取得试样800g，四分法缩减至100g，磨碎，并通过0.9mm孔径分子筛。6.3毒素提取6.3.1称取试样20.0g粉碎并通过0.9mm孔径的分子筛的样品，置于250mL具塞三角烧瓶中，加入100mL甲醇溶液，振荡30min，静置后取上清，滤纸过滤。6.3.2分装滤液，-20℃保存待测。6.4检测6.4.1用桔青霉素的抗体包被酶标板，每孔100µL，4℃，8h。6.4.2酶标板用PBS-T洗涤3次，每次3min，拍干。6.4.3分别加入不同浓度的桔青霉素的标准溶液或样品提取液（3孔平行），每孔50µL，混匀。6.4.4加入酶标桔青霉素，每孔50µL，混匀，37℃，1h。6.4.5酶标板用PBS-T洗涤3次，每次3min，拍干。6.4.6加入底物溶液，每孔100µL，37℃，10min。6.4.7加终止液，每孔50µL，终止反应。6.4.8用酶标仪在450nm波长处测定吸光度值。6.5结果处理6.5.1绘制标准曲线DB32/T1533—20093根据标准溶液所测得的OD值和标准溶液中桔青霉素含量的相关性，绘制标准曲线。根据标准曲线和待测样品的OD值，得到酶标板上桔青霉素的含量（精确到小数点后一位有效数字）。6.5.2计算所得实验数据按式（1）计算：112CVDMVW…………………………………………………（1）式中：W——桔青霉素的浓度，（µg/g）；C1——酶标板上所测得的桔青霉素的量，（µg）；V1——样品提取液的体积，（mL）；V2——酶标板上滴加样液的体积，（mL）；D——样液的总稀释倍数；M——样品重量，（g）；计算结果表示到小数点后一位有效数字。6.6重复性在相同条件下获得的两次独立测试结果的相对差值不大于15%。6.7回收率本方法的回收率为89%以上。