GB 5009.96-2016 食品安全国家标准 食品中赭曲霉毒素A的测定

中华人民共和国国家标准GB5009.96—2016食品安全国家标准食品中赭曲霉毒素A的测定2016-12-23发布2017-06-23实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局发布GB5009.96—2016Ⅰ前言本标准代替GB/T23502—2009《食品中赭曲霉毒素A的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法》、GB/T25220—2010《粮油检验粮食中赭曲霉毒素A的测定高效液相色谱法和荧光光度法》、GB/T5009.96—2003《谷物和大豆中赭曲霉毒素A的测定》、SN/T1746—2006《进出口大豆、油菜籽和食用植物油中赭曲霉毒素A的检验方法》、SN/T1940—2007《进出口食品中赭曲霉毒素A的测定方法》和SN0211—1993《出口粮谷中棕曲霉毒素A的检验方法》。本标准与GB/T23502—2009相比,主要变化如下:———标准名称修改为“食品安全国家标准食品中赭曲霉毒素A的测定”;———增加了第三法免疫亲和层析净化液相色谱-串联质谱法和第四法酶联免疫吸附测定法;———增加了适用范围并优化了提取方法;———删除了免疫亲和柱层析净化荧光光度法。GB5009.96—20161食品安全国家标准食品中赭曲霉毒素A的测定1范围本标准规定了食品中赭曲霉毒素A的测定方法。本标准第一法适用于谷物、油料及其制品、酒类、酱油、醋、酱及酱制品、葡萄干、胡椒粒/粉中赭曲霉毒素A的测定,第二法适用于玉米、稻谷(糙米)、小麦、小麦粉、大豆、咖啡、葡萄酒中赭曲霉毒素A的测定,第三法适用于玉米、小麦等粮食产品、辣椒及其制品等、啤酒等酒类、酱油等产品、生咖啡、熟咖啡中赭曲霉毒素A的测定,第四法适用于玉米、小麦、大麦、大米、大豆及其制品中赭曲霉毒素A的测定,第五法适用于小麦、玉米、大豆中赭曲霉毒素A的测定。第一法免疫亲和层析净化液相色谱法2原理用提取液提取试样中的赭曲霉毒素A,经免疫亲和柱净化后,采用高效液相色谱结合荧光检测器测定赭曲霉毒素A的含量,外标法定量。3试剂和材料除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。3.1试剂3.1.1甲醇(CH3OH):色谱纯。3.1.2乙腈(CH3CN):色谱纯。3.1.3冰乙酸(C2H4O2):色谱纯。3.1.4氯化钠(NaCl)。3.1.5聚乙二醇[HOCH2(CH2O·CH2)nCH2OH]。3.1.6吐温20(C58H114O26)。3.1.7碳酸氢钠(NaHCO3)。3.1.8磷酸二氢钾(KH2PO4)。3.1.9浓盐酸(HCl)。3.1.10氮气(N2):纯度≥99.9%。3.2试剂配制3.2.1提取液Ⅰ:甲醇-水(80+20)。GB5009.96—201623.2.2提取液Ⅱ:称取150.0g氯化钠、20.0g碳酸氢钠溶于约950mL水中,加水定容至1L。3.2.3提取液Ⅲ:乙腈-水(60+40)。3.2.4冲洗液:称取25.0g氯化钠、5.0g碳酸氢钠溶于约950mL水中,加水定容至1L。3.2.5真菌毒素清洗缓冲液:称取25.0g氯化钠、5.0g碳酸氢钠溶于水中,加入0.1mL吐温20,用水稀释至1L。3.2.6磷酸盐缓冲液:称取8.0g氯化钠、1.2g磷酸氢钠、0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾溶解于约990mL水中,用浓盐酸调节pH至7.0,用水稀释至1L。3.2.7碳酸氢钠溶液(10g/L):称取1.0g碳酸氢钠,用水溶解并稀释到100mL。3.2.8淋洗缓冲液:在1000mL磷酸盐缓冲液中加入1.0mL吐温20。3.3标准品赭曲霉毒素A(C20H18ClNO6,CAS号:303-47-9),纯度≥99%。或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。3.4标准溶液配制3.4.1赭曲霉毒素A标准储备液:准确称取一定量的赭曲霉毒素A标准品,用甲醇-乙腈(50+50)溶解,配成0.1mg/mL的标准储备液,在-20℃保存,可使用3个月。3.4.2赭曲霉毒素A标准工作液:根据使用需要,准确移取一定量的赭曲霉毒素A标准储备液(3.4.1),用流动相稀释,分别配成相当于1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL的标准工作液,4℃保存,可使用7d。3.5材料3.5.1赭曲霉毒素A免疫亲和柱:柱规格1mL或3mL,柱容量≥100ng,或等效柱。3.5.2定量滤纸。3.5.3玻璃纤维滤纸:直径11cm,孔径1.5μm,无荧光特性。4仪器和设备4.1分析天平:感量0.001g。4.2高效液相色谱仪,配荧光检测器。4.3高速均质器:≥12000r/min。4.4玻璃注射器:10mL。4.5试验筛:孔径1mm。4.6空气压力泵。4.7超声波发生器:功率180W。4.8氮吹仪。4.9离心机:≥10000r/min。4.10涡旋混合器。4.11往复式摇床:≥250r/min。4.12pH计:精度为0.01。GB5009.96—201635分析步骤5.1试样制备与提取5.1.1谷物、油料及其制品5.1.1.1粮食和粮食制品颗粒状样品需全部粉碎通过试验筛(孔径1mm),混匀后备用。提取方法1:称取试样25.0g(精确到0.1g),加入100mL提取液Ⅲ,高速均质3min或振荡30min,定量滤纸过滤,移取4mL滤液加入26mL磷酸盐缓冲液混合均匀,混匀后于8000r/min离心5min,上清作为滤液A备用。提取方法2:称取试样25.0g(精确到0.1g),加入100mL提取液Ⅰ,高速均质3min或振荡30min,定量滤纸过滤,移取10mL滤液加入40mL磷酸盐缓冲液稀释至50mL,混合均匀,经玻璃纤维滤纸过滤,滤液B收集于干净容器中,备用。5.1.1.2食用植物油准确称取试样5.0g(精确到0.1g),加入1g氯化钠及25mL提取液Ⅰ,振荡30min,于6000r/min离心10min,移取15mL上层提取液,加入30mL磷酸盐缓冲液混合均匀,经玻璃纤维滤纸过滤,滤液C收集于干净容器中,备用。5.1.1.3大豆、油菜籽准确称取试样50.0g(精确到0.1g)(大豆需要磨细且粒度≤2mm)于均质器配置的搅拌杯中,加入5g氯化钠及100mL甲醇(适用于油菜籽)或100mL提取液Ⅰ,以均质器高速均质提取1min。定量滤纸过滤,移取10mL滤液并加入40mL水稀释,经玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清,滤液D收集于干净容器中,备用。5.1.2酒类取脱气酒类试样(含二氧化碳的酒类样品使用前先置于4℃冰箱冷藏30min,过滤或超声脱气)或其他不含二氧化碳的酒类试样20.0g(精确到0.1g),置于25mL容量瓶中,加提取液Ⅱ定容至刻度,混匀,经玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清,滤液E收集于干净容器中,备用。5.1.3酱油、醋、酱及酱制品称取25.0g(精确到0.1g)混匀的试样,加提取液Ⅰ定容至50mL,超声提取5min。定量滤纸过滤,移取10mL滤液于50mL容量瓶中,加水定容至刻度,混匀,经玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清,滤液F收集于干净容器中,备用。5.1.4葡萄干称取粉碎试样50.0g(精确到0.1g)于均质器配置的搅拌杯中,加入100mL碳酸氢钠溶液,将搅拌杯置于均质器上,以22000r/min高速均质提取1min。定量滤纸过滤,准确移取10mL滤液并加入40mL淋洗缓冲液稀释,经玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清,滤液G收集于干净容器中,备用。5.1.5胡椒粒/粉称取粉碎试样25.0g(精确到0.1g)于均质器配置的搅拌杯中,加入100mL碳酸氢钠溶液,将搅拌GB5009.96—20164杯置于均质器上,以22000r/min高速均质提取1min。将提取物置离心杯中以4000r/min离心15min。移取20mL滤液并加入30mL淋洗缓冲液稀释,经玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清,滤液H收集于干净容器中,备用。5.2试样净化5.2.1谷物、油料及其制品5.2.1.1粮食和粮食制品将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下,准确移取提取方法1中全部滤液A或提取方法2中20mL滤液B,注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接,调节压力,使溶液以约1滴/s的流速通过免疫亲和柱,直至空气进入亲和柱中,依次用10mL真菌毒素清洗缓冲液、10mL水先后淋洗免疫亲和柱,流速为1滴/s~2滴/s,弃去全部流出液,抽干小柱。5.2.1.2食用植物油将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下,准确移取30mL滤液C,注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接,调节压力,使溶液以约1滴/s的流速通过免疫亲和柱,直至空气进入亲和柱中,依次用10mL真菌毒素清洗缓冲液、10mL水先后淋洗免疫亲和柱,流速为1滴/s~2滴/s,弃去全部流出液,抽干小柱。5.2.1.3大豆、油菜籽将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下,准确移取10mL滤液D,注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接,调节压力,使溶液以约1滴/s的流速通过免疫亲和柱,直至空气进入亲和柱中,依次用10mL真菌毒素清洗缓冲液、10mL水先后淋洗免疫亲和柱,流速为1滴/s~2滴/s,弃去全部流出液,抽干小柱。5.2.2酒类将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下,准确移取10mL滤液E,注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接,调节压力,使溶液以约1滴/s的流速通过免疫亲和柱,直至空气进入亲和柱中,依次用10mL冲洗液(3.2.4)、10mL水先后淋洗免疫亲和柱,流速为1滴/s~2滴/s,弃去全部流出液,抽干小柱。5.2.3酱油、醋、酱及酱制品将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下,准确移取10mL滤液F,注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接,调节压力,使溶液以约1滴/s的流速通过免疫亲和柱,直至空气进入亲和柱中,依次用10mL真菌毒素清洗缓冲液、10mL水先后淋洗免疫亲和柱,流速为1滴/s~2滴/s,弃去全部流出液,抽干小柱。5.2.4葡萄干将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下,准确移取10mL滤液G,注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接,调节压力,使溶液以约1滴/s的流速通过免疫亲和柱,直至空气进入亲和柱中,依次用10mL淋洗缓冲液、10mL水先后淋洗免疫亲和柱,流速为1滴/s~2滴/s,弃去全部流出液,抽干小柱。GB5009.96—201655.2.5胡椒粒/粉将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下,准确移取10mL滤液H,注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接,调节压力,使溶液以约1滴/s的流速通过免疫亲和柱,直至空气进入亲和柱中,依次用10mL淋洗缓冲液、10mL水先后淋洗免疫亲和柱,流速为1滴/s~2滴/s,弃去全部流出液,抽干小柱。5.3洗脱准确加入1.5mL甲醇或免疫亲和柱厂家推荐的洗脱液进行洗脱,流速约为1滴/s,收集全部洗脱液于干净的玻璃试管中,45℃下氮气吹干。用流动相溶解残渣并定容到500μL,供检测用。5.4试样测定5.4.1高效液相色谱参考条件高效液相色谱参考条件列出如下:a)色谱柱:C18柱,柱长150mm,内径4.6mm,粒径5μm,或等效柱;b)流动相:乙腈-水-冰乙酸(96+102+2);c)流速:1.0mL/min;d)柱温:35℃;e)进样量:50μL;f)检测波长:激发波长333nm,发射波长460nm。5.4.2色谱测定在5.4.1色谱条件下,将赭曲霉毒素A标准工作溶液按浓度从低到高依次注入高效液相色谱仪,待仪器条件稳定后,以目标物质的浓度为横坐标(x轴),目标物质的峰面积积为纵坐标(y轴),对各个数据点进行最小二乘线性拟合,标准工作曲线按式(1)计算:y=ax+b……………………………(1)式中:y———目标物质的峰面积比;a———回归曲线的斜率;x———目标物质的浓度;b———回归曲线的截距。标准工作溶液和样液中待测物的响应值均应在仪器线性响应范围内,如果样品含量超过标准曲线范围,需稀释后再测定。5.4.3空白试验不称取试样按5.1、5.2和5.3的步骤做空白试验。应确认不含有干扰待测组分的物质。6分析结果的表述试样中赭曲霉毒素A的含量按式(2)计算:X=ρ×V×1000m